一、背景介绍：宿主核酸的“干扰困境”

在感染性疾病诊断中，临床样本（如血液、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液等）往往含有海量的人源宿主核酸。以血液样本为例，人源DNA可占总核酸量的99%以上，而病原微生物的核酸信号——尤其是早期感染或低载量病原——极度微弱，犹如“大海捞针”。传统宏基因组测序（mNGS）虽然可以无偏倚地检测样本中的所有核酸，但因其“一网打尽”的策略，测序数据中超过90%甚至更高的有效读长来自宿主基因组，微生物读长占比极低，不仅浪费测序通量，也在一定程度上增加了检测成本和数据分析负担。

 

图1 宿主DNA去除原理示意图（高宿主含量样本中，去宿主处理显著提升微生物reads比例）

 

相比之下，靶向高通量测序（tNGS）则走出了一条截然不同的技术路线。tNGS通过特异性引物扩增或探针杂交捕获的方式，靶向富集目标病原体或相关耐药/毒力基因序列，具有高灵敏度、高效率、相对低成本等显著优势。2024年中国发布的tNGS专家共识首次规范了全流程质控标准，标志着该技术正从科研走向临床规范化应用。而tNGS与mNGS最核心的区别之一就在于“去宿主”的策略——tNGS几乎不依赖物理或酶法去除宿主核酸，而是通过巧妙的设计实现“panel限制不会扩增宿主”，从源头解决了宿主干扰问题。

 

图2  mNGS与tNGS技术路线对比（左：mNGS；右：tNGS的探针捕获与多重PCR两种方案）

二、技术的逻辑：为何说“不扩增”是更高明的策略

所谓“去宿主”，在tNGS语境下并非传统意义上的物理去除（如差异裂解法去除人源细胞、或使用DSN酶消化人源双链DNA等），而是一种 “免疫式”排除机制——通过严格设计的多重引物或杂交探针，只在病原体特异性基因区域进行扩增或捕获，而人源基因组序列根本不在引物/探针的设计靶标之内。因此，在整个tNGS实验流程中，宿主核酸虽然大量存在，但不会被富集或扩增，自然也就不会进入下游测序数据。

 

这种策略的优势是显而易见的：

 

其一，降低背景噪音，提升病原检出灵敏度。 由于测序读长高度集中于目标病原体区域，病原核酸信号被有效放大，即使病原载量极低、Ct值高达35以上的样本，也能获得可靠的检测结果。有研究显示，采用“反向去宿主+正向探针捕获”双重富集策略的tNGS产品，在血液、脑脊液、眼科样本、石蜡切片等棘手样本中，病原阳性率显著优于传统mNGS。

 

其二，降低测序数据量需求与检测成本。 因为不需要对全基因组进行测序，tNGS仅需约mNGS 1/10甚至更低的数据量即可获得等效的病原鉴定能力，大幅降低了检测费用，使其具备了大规模临床推广的经济可行性。

 

其三，简化实验流程，缩短检测周期。 相较于mNGS建库前需要额外进行宿主DNA去除步骤（如差异裂解、探针杂交捕获+DSN酶消化等），tNGS的扩增子法或杂交捕获法在文库构建过程中即自动完成了“去宿主”的功能，无需单独处理环节，检测时间可压缩至15～20小时内。

 

三、常见实验方案：两种主流路径的比较

目前tNGS技术主要采用两种富集策略实现“panel限制不扩增宿主”目标：

 

方案一：多重PCR扩增子法

 

该方法通过设计超多重特异性引物组，对目标病原体核酸进行高效PCR扩增，显著提高目标序列的覆盖率。其核心逻辑非常清晰：引物只设计在病原体保守基因区（如细菌的16S rRNA基因、真菌的ITS区域、病毒的保守蛋白编码区等），不设计任何针对人源基因组序列的引物，因此即使样本中含有大量人源DNA模板，PCR阶段也不会产生宿主来源的扩增子。扩增子法的优势在于起始量要求低、灵敏度极高、检测下限可达Ct值35以上，适用于低载量病原体检测，且实验流程简洁、成本相对较低。

 

方案二：探针杂交捕获法

 

该方法通过设计覆盖病原体全基因组或关键区域的高密度探针池，在液相中与文库中的病原体DNA/RNA片段进行特异性杂交，随后通过磁珠等介质捕获目标序列。探针杂交捕获技术的核心在于探针设计的“靶向性”——探针序列仅与病原体参考基因组匹配，与人源基因组不存在同源区域，从而在杂交捕获步骤中自动排除了人源序列的干扰。杂交捕获法的优势在于检测谱更广，可覆盖数千种病原体，尤其适用于未知病原或突变频繁的RNA病毒；对结构变异和复杂区域的检测能力也更强，但起始核酸量要求相对较高。

 

需要指出的是，tNGS技术存在一个天然局限：只能检出panel中已设计靶标的病原微生物，无法发现数据库中没有的新病原体。然而，mNGS与tNGS并非替代关系，二者在临床场景中各有定位——tNGS适用于已知病原谱的筛查、耐药快速诊断，而mNGS则更适合疑难未知病原的探索性检测。

 

图3  tNGS全流程实验方案（RNA & DNA共检）

 

 

 

 

四、总结：tNGS“去宿主”的本质是精准聚焦

病原tNGS“去宿主”的本质，并非是复杂的去除技术，而是回归检测的初心——用最精准的工具，锁定最想要的靶标。通过多重PCR扩增子或探针杂交捕获的技术路径，tNGS巧妙地规避了对宿主核酸的富集与扩增，从而在低载量病原检测、高宿主背景样本中展现出不可替代的优势。对于感染性疾病临床诊断而言，tNGS提供了“快速、精准、经济可行”的新选择，正逐步成为临床微生物实验室的标准工具之一。

【翌圣生物产品推荐】