在宏基因组测序的浩瀚海洋中，每一份样本都蕴藏着微生物群落的“密码”。从土壤的碳循环到肠道的健康密码，从海洋生态到临床诊断，宏基因组测序正成为生命科学的“破冰船”。然而，这艘船能否顺利启航，关键取决于第一关——核酸提取。它不仅是技术门槛，更是数据质量的“生命线”。若提取失败，后续测序将如沙上建塔，数据偏差、低覆盖率甚至实验报废，让研究者前功尽弃。今天，我们带您深度解析这“第一关”的奥秘，助您轻松跨越瓶颈。

一、背景：宏基因组测序的崛起与挑战

快速准确的微生物鉴定始终是临床微生物学关注的焦点。传统方法如形态学检查、培养分离、抗原抗体检测及靶向核酸检测，在应对疑难及未知病原微生物时存在明显局限性，mNGS技术的出现打破了这一困境。它直接针对样本中所有核酸进行无偏倚测序，结合病原微生物数据库及特定算法，可检测样本中含有的可能病原微生物序列。随着技术成本不断降低和流程不断完善，mNGS已逐渐从科研走向临床应用，成为疑难和未知病原微生物检验的重要手段。

在临床实践中，mNGS的价值已得到充分验证。但是，mNGS技术的准确性高度依赖标本中微生物的核酸质量及含量，也依赖于不同类别微生物核酸的提取效率。核酸提取，成为决定mNGS成败的第一道关卡。

二、实验原理

mNGS技术流程包括：样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序、数据库比对、报告解读。其中，核酸提取处于整个流程的起点，其质量直接影响后续所有步骤。

核酸提取的核心目标是获得高质量、高纯度的总核酸（DNA或RNA），真实反映样本中微生物的组成。然而，这一目标面临多重挑战：

1. 微生物细胞壁的差异

不同微生物的细胞结构差异巨大。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，真菌细胞壁含有几丁质，分枝杆菌则具有厚厚的脂质层，病毒则需要考虑包膜有无。特别是真菌和分枝杆菌，需要特定的破壁处理才能有效释放核酸。

2. 样本基质的复杂性

临床样本类型多样，包括血液、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、粪便、组织等。每种样本都有独特的干扰物质：血液中的血红蛋白和免疫球蛋白、痰液中的粘蛋白、粪便中的腐殖酸和多糖、组织中的胶原蛋白等，这些都可能抑制下游酶反应或干扰测序。

3. 人源核酸的干扰

临床样本中往往含有大量人源细胞，其核酸会占据大部分测序数据，降低微生物检测的灵敏度。因此，在核酸提取过程中引入降低人源核酸的处理方法至关重要。

4. DNA与RNA的差异

DNA和RNA的化学性质不同，提取方法也有差异。DNA相对稳定，而RNA极易被RNase降解。如果临床上怀疑病毒感染，特别是RNA病毒，需要考虑同时进行DNA和RNA测序。

三、核酸提取的两种方式——柱式和磁珠法

        1、硅胶膜离心柱法

硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子桥能够中和DNA和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。

该方法具有实验流程操作简单、价格低廉、提取浓度效果好，浓度高等优点。

图1 硅胶膜离心柱法核酸提取流程（图片来源：网，侵删）

        2、磁珠法吸附提取法

运用纳米技术，对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。在盐酸胍、异硫氰酸胍和外加磁场的作用下，能从血液样本中分离出DNA，并洗去非特异性吸附的杂质，得到纯化后的DNA，可应用于实验室检测。磁珠法提取的原理，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，可以应用在血液、组织、拭子、鼻咽分泌物等样本之中。

该方法能够实现自动化、大批量的实验操作。操作简单，用时短，整个流程大约可以在30分钟内完成。同时安全无毒，符合环保理念。磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

图2 磁珠法核酸提取流程（图片来源：网，侵删）

四、核酸提取的质量控制要点

mNGS检测的核酸提取质量应满足以下要求：

1. 提取效率：能够有效裂解各类微生物细胞，特别是难破壁的真菌和分枝杆菌。
2. 纯度要求：去除样本中的各种抑制因子，确保下游酶反应不受干扰。
3. 完整性：提取的核酸片段完整，无明显降解。
4. 重复性：相同样本的提取结果应具有良好的重复性。
5. 防污染：提取过程中需设置空白对照，监控交叉污染。

实验室应通过已知样本确立不同类型样本个性化的测序数据量、验证序列质量值、确定判读标准。

五、总结

宏基因组测序技术为感染性疾病诊断带来了革命性变化，它以无选择性、结果快速、适用各类临床样本的优势，成为传统方法难以为继时认可度最高的检测手段。然而，再先进的技术也需要坚实的基础。核酸提取作为宏基因组测序的"第一关"，其质量直接决定了整个实验的成败。从样本前处理到细胞裂解，从核酸纯化到质控检测，每一步都需要精心优化和严格质控。

针对不同类型样本和微生物，选择合适的核酸提取方案至关重要。翌圣生物致力于为宏基因组测序提供完整的核酸提取解决方案，从粪便样本到土壤环境，从DNA到RNA，助力科研人员和临床医生闯过宏基因组测序的"第一关"，让病原检测更加精准、可靠。

翌圣生物磁珠法提取试剂选择指南

分类	样本类型	产品名称/货号
病原检测	（血清、血浆、脑脊液、鼻/咽拭子、肺泡灌洗液等）样本中提取病毒核酸（DNA和RNA）	磁珠法通用病毒DNA/RNA提取试剂盒（18521ES）
	（血清、血浆、脑脊液、鼻/咽拭子、肺泡灌洗液等）样本中提取病原核酸（DNA和RNA）	磁珠法病原DNA/RNA提取试剂盒（18306ES）
	（血清、血浆、脑脊液、鼻/咽拭子、肺泡灌洗液等）样本中提取病原核酸（DNA和RNA）	磁珠法血液病原DNA/RNA提取试剂盒（18307ES）
	土壤、粪便、水样、水体滤膜、细菌、真菌等环境样本基因组DNA	磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒（18526ES）
	培养的革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌和真菌DNA	磁珠法细菌真菌DNA提取试剂盒（18565ES）

翌圣生物柱式提取试剂选择指南

分类	样本类型	产品名称/货号
多类型样本	动物细胞、组织、常规植物样本	总RNA提取试剂（同TRIzol）（10606ES）
		总RNA提取试剂盒（带离心柱）（19211ES）
	各类液体样本	液体总RNA提取试剂（同TRIzol LS）（19201ES）
医疗样本	细胞、组织	细胞/组织DNA提取试剂盒（18700ES）
		海洋动物DNA提取试剂盒（18725ES）
		微量样本DNA提取试剂盒（18780ES）
		细胞/组织总RNA提取试剂盒（19221ES）
		培养细胞RNA提取试剂盒（19231ES）
		细胞/组织miRNA提取试剂盒（19331ES）
	血液、血清、血浆	血液DNA提取试剂盒（18730ES）
		血液/血清RNA提取试剂盒（19241ES）
		血清/血浆miRNA提取试剂盒（19332ES）
	拭子类	拭子样本DNA提取试剂盒（18790ES）
	医疗样本中及培养物中的病毒	病毒DNA/RNA提取试剂盒（19321ES）