抗体亲和纯化系列——抗体纯化，不二之选
Protein A、Protein G、Protein L背景介绍
Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。将Protein A、G分别固定在不同的介质上，或同时将Protein A、G共价偶联到介质表面，是从腹水、细胞培养物上清和血清中分离IgG和IgG亚家族的有效工具。
将蛋白样本Protein A和Protein G纯化IgG，IgG片段和亚类的基础是二者对IgG-类型的多克隆抗体和单克隆抗体具有很高的特异性亲和力。
图1.Protein A、G亲和性
Protein L源于细菌，能更广泛地结合各种类型以及亚类的免疫球蛋白，包括所有类型的IgG和单链可变区(ScFv)以及Fab片段。该蛋白只与抗体的kappa链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与蛋白A或蛋白G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体。
Yeasen生物提供一系列以蛋白A、蛋白G与蛋白L为核心的抗体纯化工具，涵盖不同类型填料树脂及自动层析预装柱，方便使用手动或自动化方式纯化抗体蛋白质。
Protein A、G、L树脂的差异分析
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Beads |
Protein A |
Protein G |
Protein A/G |
Protein L |
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优点 |
高流速； 结合能力强； 特异性与IgG的Fc片段结合 |
高流速； 结合能力强； 与IgG的Fc和Fab片段结合 |
高流速； 结合范围更广，兼容A\G共同点； 结合能力更强； 实用性更高 |
几乎可以结合所有的Ig类(IgG，IgM，IgA，IgE和IgD)； 还可以结合单个轻链（Scfv）和Fab片段 |
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缺点 |
宿主细胞蛋白的一些非特异性结合 |
不能像蛋白A一样耐受苛刻的洗脱条件 |
不结合牛、山羊或绵羊来源的免疫球蛋白 |
附表1是关于蛋白A和蛋白G对于不同的免疫球蛋白相对结合力的比较，可用于预测蛋白A或蛋白G作为亲和介质时的选用指导。对于来自特别物种IgG的最佳结合条件，应该查阅近期的文献，获得最有价值的信息。
翌圣纯化产品选择指南
Yeasen生物抗体纯化类工具，以基因改造后的Protein A/G、Protein L为原料，通过不同化学方法将其定向、高效的偶联到琼脂糖基质上，不仅降低了蛋白的非特异性结合、实现了树脂较高的抗体载量，同时也获得了适用于不同纯化要求的抗体纯化产品。
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产品系列 |
普通型纯化树脂系列 |
快速型纯化树脂系列 |
预装柱系列 |
磁珠系列 |
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Protein A、G 、A/G、L Agarose |
Protein A、G 、A/G、L 4FF Agarose |
Protein A、G、L 4FF Chromatography Column |
Protein A/G MagBeads (IP Grade) |
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平均粒径d50V |
45-165µm |
45-165µm |
45-165µm |
1μm |
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配基 |
重组蛋白 |
重组耐碱蛋白 |
重组耐碱蛋白 |
重组Protein A/G |
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载量 |
Protein A > 40mg人IgG/mL Protein G > 30mg人IgG/mL Protein A/G > 20mg人IgG/mL Protein L > 15mg人IgG/mL |
＞50µg人IgG /mg |
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最大操作压力 |
0.1MPa,1bar |
0.3MPa,3bar |
0.3MPa,3bar |
- |
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支撑物 |
4%琼脂糖微球 |
高度交联4%琼脂糖微球 |
高度交联4%琼脂糖微球 |
聚合物磁性微球 |
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优势 |
非特异性结合低，高载量 |
非特异性结合极低，高载量高流速，强稳定性 |
柱效稳定，高载量，高流速，强稳定性 标准接口适配商品化各类中压色谱系统 |
高纯度，高载量，高特异性，配套磁力架使用方便 |
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推荐应用 |
任意规模抗体纯化 |
任意规模抗体纯化，IP，COIP |
小规模抗体纯化 |
抗体纯化，重组蛋白纯化，IP，COIP |
纯化方法
亲和纯化是一种具有可逆反应的生化分离纯化技术，如抗原与抗体。适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。如图1所示，首先填料与介质偶联，结合形成具有特异亲和性的分离介质，再向柱子中注入样本，配体选择性的吸附目标物质，平衡液洗杂，最终用洗脱液将目标物质进行洗脱。
图2. 亲和层析示意图
纯化实例
即使使用结合鼠单抗IgG1比较弱的Protein A 1mL预装柱，纯化效率也高于90%。
图3. Protein A纯化结果示意图
FAQ
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常见问题 |
原因分析 |
推荐解决方案 |
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柱子反压过高 |
筛板堵塞 |
清洗或更换筛板 |
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填料堵塞 |
参照说明书树脂清洗 |
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裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45μm)过滤，或者离心去除 |
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样品纯化过程中曲线不稳定 |
样品或Buffer中含气泡 |
去除样品或柱子中的气泡 |
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样品和buffer进行脱气 |
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洗脱组分中没有目的蛋白 |
样品中抗体浓度太低 |
适当提、高抗体浓度 |
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抗体被降解 |
蛋白洗脱后应立即中和，适当提高洗脱液pH |
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样本与纯化介质柱不匹配 |
参照表1选择合适的纯化介质 |
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电泳loading buffer DTT失效 |
使用新鲜配制loading buffer |
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洗脱缓冲液pH不对 |
依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，电泳检测产物 |
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结合缓冲液pH不对 |
应保证样本和结合缓冲液pH在7.0 |
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回收率逐渐降低 |
上样量过多 |
减少上样量 |
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柱子太脏，载量降低 |
参照说明书进行树脂清洗 |
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样本中脂蛋白、酚红、小分子污染物等的去除 |
每毫升样品中加入0.04mL硫酸右旋葡糖酐和1mL 1M CaCl2沉淀脂蛋白，离心除去 |
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PVP加入样品中至终浓度为3%沉淀b-脂蛋白和球蛋白，离心去除 |
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结合缓冲液稀释样本 |
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脱盐柱除去酚红 |
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分级沉淀法去除低分子污染物，可采用硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀等方法 |
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抗体药物纯化过程中，降低聚集体含量 |
在上游细胞培养，控制最佳的收获时机，避免培养过程中抗体聚集 |
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低pH洗脱液中，加入保护剂（Arg等） |
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低pH洗脱后，快速中和 |
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适当降低亲和层析柱进样量 |
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样品处理和纯化过程中，保持低温（4-8℃） |
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订购信息
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产品名称 |
货号 |
规格（mL） |
价格（元） |
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36401ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
546/2186/7426 |
|
|
36402ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
866/2656/8856 |
|
|
36403ES03/05/08/25/60 |
1/2/5/25/100 |
278/538/878/2886/7426 |
|
|
36404ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
978/3186/8726 |
|
|
36405ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
546/2186/7426 |
|
|
36406ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
978/3186/8726 |
|
|
36407ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
2488/9988/16488 |
|
|
36408ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
2868/13288/27688 |
|
|
36409ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
528/2218 |
|
|
36410ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
1848/6838 |
|
|
36413ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
528/2218 |
|
|
36414ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
1848/6838 |
|
|
36415ES03/08 |
1 mL/5×1 mL |
938/3748 |
|
|
36416ES08/25 |
5 mL/5×5 mL |
3528/14088 |
|
|
36417ES03/08 |
1/5 |
787/2937 |
参考文献
[1] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407.
[2] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412.
[3] Chen Y, Tang J, Lu T, Liu F. CAPN1 promotes malignant behavior and erlotinib resistance mediated by phosphorylation of c-Met and PIK3R2 via degrading PTPN1 in lung adenocarcinoma. Thorac Cancer. 2020;11(7):1848-1860 Protein A/G MagBeads IF: 2.61
[4] Zhao Q, Liu Y, Wang T, et al. MiR-375 inhibits the stemness of breast cancer cells by blocking the JAK2/STAT3 signaling [published online ahead of print, 2020 Jul 30]. Eur J Pharmacol. 2020;884:173359.
Protein A/G Agarose Resin IF: 3.263
附表:
附表1 蛋白A和蛋白G对不同免疫球蛋白的结合力
|
免疫球蛋白来源 |
亚类 |
蛋白A结合力 |
蛋白G结合力 |
|
人类Human |
IgG |
+++ |
+++ |
|
IgG1 |
++++ |
++++ |
|
|
IgG2 |
++++ |
++++ |
|
|
IgG3 |
- |
+++ |
|
|
IgG4 |
++++ |
++++ |
|
|
IgA |
可变的 |
- |
|
|
IgA1 |
+ |
- |
|
|
IgA2 |
+ |
- |
|
|
IgD |
- |
- |
|
|
IgE |
++ |
- |
|
|
IgM |
+ |
- |
|
|
兔Rabbit |
IgG |
+++ |
+++ |
|
牛Cow |
IgG |
+ |
+++ |
|
IgG1 |
+ |
+++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
猫Cat |
IgG |
+++ |
+ |
|
马Horse |
IgG |
++ |
++++ |
|
山羊Goat |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
+++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
豚鼠Guinea pig |
IgG1 |
++ |
+ |
|
IgG2 |
++ |
+ |
|
|
绵羊Sheep |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
++ |
|
|
IgG2 |
+++ |
+++ |
|
|
狗Dog |
++ |
+ |
|
|
猪Pig |
+++ |
++ |
|
|
大鼠Rat |
IgG |
+ |
++ |
|
IgG1 |
- |
+ |
|
|
IgG2a |
- |
++++ |
|
|
IgG2b |
- |
++ |
|
|
IgG2c |
++ |
++ |
|
|
IgG3 |
+ |
++ |
|
|
小鼠Mouse |
IgG |
++ |
++ |
|
IgG1 |
+ |
++++ |
|
|
IgG2a |
++++ |
++++ |
|
|
IgG2b |
+++ |
+++ |
|
|
IgG3 |
++ |
+++ |
|
|
IgM |
- |
- |
|
|
鸡Chicken |
IgY |
- |
- |
|
恒河猴Monkey rhesus |
IgG |
++++ |
++++ |
|
仓鼠Hamster |
+ |
++ |
|
|
考拉Koala |
- |
+ |
|
|
美洲驼Llama |
- |
+ |
HB201215
