离子霉素(Ionomycin)，一种来源于Streptomyces conglobatus的聚醚类窄谱抗生素，是一种有效的钙离子载体，高度选择性结合钙离子，也能转运其他离子，但亲和力相对较低(Ca2+ >Mg2+ >>Sr2+=Ba2+)。Ionomycin通过直接刺激钙池调控钙内流，提高胞内钙离子水平。Ionomycin常用的有效浓度为：1-10 μM。
图1 离子霉素游离酸分子结构式(CAS NO: 56092-82-0)
图2 离子霉素钙盐分子结构式(CAS NO: 56092-82-1)
在细胞内，Protein kinase C (PKC)的激活，可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达，进而引起细胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Ca2+共同作用下被激活。Ionomycin常与PKC激活剂PMA联用，刺激免疫细胞活化，同时也加入蛋白转运抑制剂（通常是Monensin或Brefeldin A）阻止高尔基体将新分泌蛋白运输到细胞外，以增强细胞内细胞因子的检测。如果是对分泌蛋白进行免疫检测（例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测），则无需使用Monensin或Brefeldin A对细胞进行处理。
PMA和Ionomycin活化免疫细胞产生细胞因子步骤（用于流式检测）
1、试剂准备
① Ionomycin, 0.5 mg/mL用纯乙醇配制。分装为20 μL/管，–20°C可保存6个月。
② Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/mL用DMSO配制。分装为20 μL/管，–20°C可保存6个月。
2、无菌条件下从健康人的外周血中分离PBMC。
① 用无菌PBS按照1：1稀释全血；
② 加入等体积的Ficoll-Paque，室温下400× g离心20-30 min；
③ 收集交界处的PBMC，加入无菌PBS，4°C下300× g 离心5 min，丢弃上清液，重复两次洗涤细胞；
④ 加入RPMI 1640完全培养基重悬细胞，继续培养；
3、PMA/Ionomycin刺激细胞
收集细胞计数，用新鲜培养基重悬至细胞密度为1~2×106 cells/mL，加入PMA (10 ng/mL)和Ionomycin (1 μg/mL)混匀，37 ℃ 5% CO2培养4~6 h（不要超过6 h）
注：根据实验需求，选择是否需要加入蛋白转运抑制剂Monensin或Brefeldin A。
4、4°C下300× g 离心5 min，去除上清，收集细胞进行流式细胞染色，检测细胞因子表达情况（如IFN-γ、IL-2、TNF-α等）。
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