随着各种基因组测序项目的完成，越来越多的基因被发现，但多数基因功能不明，故研究基因的功能十分重要。分子克隆是基因功能研究中基础和关键的内容。利用分子克隆技术将外源基因插入质粒载体，进行外源基因的表达可能不是一件难事。但要同时表达多个基因时，传统的方法可能就比较困难。下面给大家介绍一种多个外源基因表达的方法——构建多顺反子表达载体。
今天我们以EGFRvIII基因、P2A多顺反子元件、iRFP720基因插入到pLVX-TetOne载体中为例，介绍如何利用传统酶切酶连技术和同源重组技术进行构建多顺反子表达载体。
粘性末端克隆
使用传统酶切酶连法进行克隆时，首先需要分析酶切位点，经分析发现只有AgeI和BstZ17I两个酶切位点可用于EGFRvIII基因克隆，因为另外两个酶切位点BamHI和EcoRI同时存在于EGFRvIII基因的内部，导致无法使用。而P2A元件和iRFP720基因必须和EGFRvIII基因处于同一个读码框，又导致无法使用AgeI酶切位点进行后续的克隆。针对这种酶切位点无法选择的情况，我们可以选择不需要考虑酶切位点的同源重组技术。
一步法克隆
使用同源重组技术无需考虑载体的酶切位点，只需在目的片段特异性上、下游引物5’端引入与线性化载体末端同源序列（15-25bp）即可。
1.制备线性化载体：可以用PCR或酶切的方式得到线性化的pLVX-TetOne载体。（最好胶回收纯化）
2.目的基因的引物设计：EGFRvIII上游引物、RFP720下游引物分别与线性化的pLVX-TetOne载体具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之间也有15-25bp的同源序列。（这里要提到的是，P2A元件很短，仅有66 bp，有可能被重组酶中的外切酶彻底降解。我们可以通过两轮PCR，在扩增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可获得P2A + iRFP重组片段。对于这种目的基因过短的情况，可以采取这种方式。）
给大家安利一款同源重组引物设计软件：
http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/
软件使用特别方便，只要在左侧选择载体线性化方式以及插入的片段数，根据网页填写基本信息点击生成引物，最后就可以获得完整插入DNA片段的上下游引物啦，快快收藏起来吧！
3. 目的基因的扩增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三个基因的扩增。（最好胶回收纯化）
4. 重组反应：将EGFRvIII，P2A及iRFP720三个基因同时插入到pLVX-TetOne载体中。
5.转化：将重组反应物转化到克隆感受态细胞中。
6.克隆鉴定：通过菌落PCR，双酶切或测序鉴定阳性克隆。
7. 表达：转到表达感受态中进行表达。实现Tet-on诱导表达EGFRvIII基因，同时还能表达iRFP720基因，用于小动物活体荧光成像。
