1）Equilibration缓冲液：用于维持一定的反应条件，缓冲液中的Mg²⁺降低背景，Mn²⁺增强染色效果。

2）蛋白酶K（Proteinase K）：通透细胞膜和核膜，保证TUNEL探针进入细胞中，保证染色充分。

3）荧光素-dUTP：标记3'-OH末端和作为TdT酶的底物。

4）TdT酶：催化dUTP标记3'-OH末端的关键酶。

1）阳性组：用DNase酶处理，诱导细胞凋亡、暴露出3'-OH末端。每次实验做一个即可。

2）阴性组：不加TdT酶，其余操作和实验组相同。每种切片样本各需要做一个阴性对照。比如有5个老鼠的肺组织切片样本，那么就需要做5个阴性组。

3）实验组：除了阳性组和阴性组，所有的样本均是实验组。

1）阳性组：用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题。

2）阴性组：a.排除细胞自身凋亡以及操作过程等原因导致的非特异性染色；b.调整拍摄曝光强度。

若已知细胞或者组织样本处于细胞凋亡状态，但是用TUNEL试剂盒检测发现荧光信号偏弱或没有信号。

4.1 样本处理不当

1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。
2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min，再使用二甲苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。

3）Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间，常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

4）Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL。

5）放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜，减低染色效率。建议使用新鲜切片。

4.2 染色操作不当

6）染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

7）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。

8）TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致TdT酶失活。

9）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。

4.3 荧光检测操作不当

10）操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。

若已知细胞或者组织样本依然处于活细胞状态，但是用TUNEL试剂盒检测，出现了非特异性染色，和处理过的荧光信号一样强，甚至比阳性对照组荧光信号还要强。

5.1 样本处理不当

1）使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。

2）固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

3）固定时间过长，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min。

4）蛋白酶K处理时间过长，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当缩短处理时间。

5）蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶 K溶液浓度，一般工作液浓度为20 μg/mL。

5.2 染色操作不当

6）TUNEL染色时间过长。建议一般是 37 ºC 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。

7）未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。

6.1 染色操作不当

1）TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当，一般是 37 ºC 孵育60 min，避免串色。

2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。

3) 使用试剂盒提供的二价阳离子优化反应，试剂盒中的Mg²⁺可降低背景，Mn²⁺可增强染色效果。

4）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。

6.2 荧光检测操作不当

5）曝光时间过长。建议调整曝光条件，先对阴性组调整到无背景光，然后用这个曝光条件去拍摄实验组（可以微调，但是不需要大调）。