产品简介

 

游离胆固醇(FC)是构成细胞膜的主要成分，也是合成性激素、胆汁酸、维生素D和肾上腺皮质激素等物质的重要原料，FC浓度可作为脂代谢的指标。本试剂盒的检测方法是微量法，既可以用可见分光光度计检测，也可以用酶标仪检测。

作用原理是FC氧化酶可催化FC生成4-胆甾烯酮和H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，其在500 nm有吸收峰，颜色深浅与FC含量成正比。作用方式如下：

测定总胆固醇(TC)请选择60723ES 总胆固醇(TC)含量检测试剂盒；测定游离胆固醇(FC)请选择60724ES 游离胆固醇(FC)含量检测试剂盒。

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	规格	储存条件
60724-A	试剂一	30 mL	2～8℃
60724-B	试剂二	160 μL	2～8℃
60724-Ｃ	标准品	10 mg	2～8℃

 

储存条件

 

2～8℃保存，有效期6个月。

 

使用说明

 

【注意事项】实验之前建议选择3个预期差异大的样本做预实验，如果样本吸光值不在测量范围内，建议稀释或者增加样本量进行检测。

1.需自备的仪器和溶剂：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、EP管、蒸馏水和异丙醇。

2.溶液的配制：

1）自备提取液异丙醇：大约需要110 mL，常温保存；试剂盒内提供一个30 mL棕色空瓶，仅做分装使用。

2）标准品溶液的配置：10 mg胆固醇使用前加入517 μL提取液，振荡溶解后即为50 μmol/mL的胆固醇标准溶液，2～8℃可保存4周。

3）工作液的配制：根据样本量将试剂一：试剂二按 3 mL：20 μL（约16T）的比例配制工作液，现用现配。

3.操作步骤：

1）样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

a.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5～10 的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。10000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

b.细菌/细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500～1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300 w，超声2秒，间隔3秒，总时间3 min）；然后 10000 g，4℃离心10 min， 取上清置于冰上待测。

c.血清（浆）等液体样本：直接测定，若有沉淀请离心后取上清待测。

2）测定步骤

a.可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至500 nm，分光光度计蒸馏水调零。

b.按需取出一定量的工作液，临用前37℃预热10 min以上。

c.将50 μmol/mL胆固醇标准品用提取液进行稀释得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μmol/mL的标准品备用。

序号	稀释前浓度（μmol/mL）	标准品体积（μL）	提取液体积（μL）	稀释后浓度（μmol/mL）
1	50	50	950	2.5
2	2.5	800	200	2
3	2	625	375	1.25
4	1.25	500	500	0.625
5	0.625	500	500	0.3125
6	0.3125	500	500	0.15625

备注：下述实验中每个标准管需20 µL标准品（注意不要在此步骤直接检测吸光度）。

d.在1.5 mL EP管/96孔板按下表步骤加样

试剂名称（µL）	测定管	标准管	空白管
样本	20	-	-
标准品	-	20	-
提取液	-	-	20
工作液	180	180	180
充分混匀，37℃静置30 min，反应完成后测定500 nm处吸光值A，分别记为A测定、A标准和A空白，ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准管只需测1-2个。注：若样本为血清，则空白管中的提取液（异丙醇）需要更换为蒸馏水进行实验，计算ΔA 测定=A测定-A血清（浆）空白，标准管测定及ΔA标准计算不变。

4.总胆固醇含量计算：

a.根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

b.游离胆固醇的计算

（1）按血清（浆）等液体体积计算：FC含量（μmol/dL）=x×100×F

（2）按样本蛋白浓度计算：FC含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）×F =x÷Cpr×F

（3）按样本质量计算：FC含量（μmol/g 质量）=x×V提取÷W×F =x÷W×F

（4）按细胞/细菌数量计算：FC含量（μmol/10⁶ cell）=x×V提取÷N×F =x÷N×F

100：单位换算系数，1 dL=100 mL；V提取：加入样本的提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；N：细胞/细菌总数，以10⁶计；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；F：样本稀释倍数。

5.实验实例：

（1）取0.1054 g大鼠肾脏加入1 mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA测定=A测定-A空白=0.385-0.067=0.318，根据标准曲线y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，计算x=0.788，按样本质量计算含量得：FC 含量（μmol/g 质量）=x÷W×F =7.476 μmol/g 质量。

（2）取 5×10⁶个BNL细胞加入1 mL提取液进行超声破碎，按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA测定=A测定-A空白=0.112-0.067=0.045，根据标准曲线y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，计算x=0.100，按细胞数量计算含量得：FC 含量（μmol/10⁶ cell）= x÷N×F =0.02 μmol/10⁶ cell。  

（3）取人血清样本，直接按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA测定=A测定-A空白=0.194-0.067=0.128，根据标准曲线y=0.3971x+0.0051，R²=0.9981，计算x=0.309，按血清（浆）等液体体积计算含量得：FC 含量（μmol/dL）=x×100×F=30.7 μmol/dL。

 

注意事项

 

1.如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用提取液稀释样本（血清（浆）用蒸馏水稀释）后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2.提取液中含有使蛋白变形的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4.本产品仅作科研用途！

 

 

Ver.CN20240924