产品描述
目前常用的细胞增殖标记物有4种,DNA聚合酶α(DNA polymerase α),增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA),Ki-67和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)。其中Brdu为组织细胞非内源性表达存在,应用相对较广。Brdu,也称为溴化去氧尿苷,一种合成的胸苷类似物,在S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中。从而检测细胞DNA合成和标记细胞分裂,凋亡等行为。在遗传研究中Brdu可通过活体注射或细胞培养加载,然后使用抗Brdu的单克隆抗体进行特异性标记,ICC或IHC法染色法显示增殖细胞。另外,还能同时结合其它细胞标记物,双重染色,来判断增殖细胞的种类,增殖速度等,对研究细胞动力学有着重要意义。
产品性质
中文别名(Chinese Synonym) |
5-溴-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖)尿嘧啶;5-溴脱氧尿苷;溴化去氧尿苷; |
英文别名(English Synonym) |
Br-dU; BUdR; 5-BrdU; 5-Bromodeoxyuridine; |
CAS号(CAS NO.) |
59-14-3 |
分子式(Formula) |
C9H11BrN2O5 |
分子量(Molecular Weight) |
307.10 |
外观(Appearance) |
白色或类白色粉末 |
熔点(Melting Point) |
187-189℃ |
纯度(Purity, HPLC) |
≥99% |
溶解性(Solubility) |
溶于1M 氢氧化铵(50 mg/mL),水(高达10 mg/mL);溶于DMF,DMSO,水(加热)(50-100 mg/mL) |
结构式(Structure) |
运输和保存方法
冰袋运输。-25~-15℃干燥保存,有效期2年。
操作步骤
1. Brdu储存液的准备用1X DPBS充分溶解适量的Brdu配置10 mg/mL的母液,过滤除菌后,按照0.5 mL/管的量分装放在-20°C或者-80°C长期保存,避免反复冻融。Brdu储存液再融化后,4°C可稳定存放一周。
2. 体内Brdu标记
1)腹腔注射法(常用):无菌的10 mg/mL(溶于DPBS)适合用于体内注射用。按照100-200 μL(1-2 mg) Brdu的量腹腔注射到小鼠体内。注意:最短在注射后0.5 h后在小肠,胸腺和骨髓瘤处就能检测到Brdu。而一般在注射后24 h内几乎所有组织都能检测到Brdu。这个时间可能对于一些快速分化的组织如小肠来说有些久。
2)根据自身的实验体系,在合适的时间点处死动物,摘除待研究的组织。使用冰冻切片或者石蜡包埋的方法进行组织处理和切片制备。然后进入后续的IHC染色步骤。
3. 体外Brdu标记(培养原代细胞或者细胞系)
注:总的来说,10 μM Brdu(稀释于培养液)是一个比较合适的方法用来标记不同物种来源的原代细胞或细胞系。当然,建议针对具体的实验体系优化方法。
1)在96孔板上按标准步骤进行细胞培养,培养时间一般为1-72 h;
2)Brdu工作液的准备:用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL组织培养液即得到最终工作液。37°C温热。
3)按100 μL/孔Brdu工作液的量进行细胞标记,37°C孵育60 min~过夜。同时设置非Brdu标记的细胞作为阴性对照。注意:最佳的孵育时间取决于细胞增殖速度以及需要达到的实验目的。比如,对于快速增殖细胞(如HL-60)有效孵育时间为30-45 min;对于原代细胞(如未受外源刺激培养的外周血淋巴细胞)孵育时间可能需要24 h。细胞密度最好不要超过2x106 cells/mL。
4)制备单细胞层玻片,使用以下任何一种方法:
a. 细胞离心涂片(cytospin)制备:使用细胞离心涂片机,将100 μL标记好的细胞(浓度为:1-2 x106 cells/mL)直接离心到干净,无脂肪,poly-L-lysin包被的玻片上,风干。
b. 细胞涂片(cell-smear)制备:取一小滴标记好的细胞悬液于干净,无脂肪,poly-L-lysin包被玻片的一端,然后用第二个干净玻片将其均匀涂布成一薄层。室温风干。
5)将玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min(也可选择4%多聚甲醛固定15min)。
6)PBS清洗细胞3次,每次5 min。
7)加入2M HCl中室温孵育30 min-60min。注意:DNA的变性对于Brdu染色的成功至关重要。
8)吸去HCl,PBS清洗2次,每次5 min。
9)用0.1M Na2B4O7 (等体积步骤7)2M HCl的量)室温浸泡15min,PBS浸洗玻片3次,每次10min (适当延长时间和加大体积,完全洗净);
10)吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min;
11)吸水纸吸掉封闭液,勿清洗,滴加足量稀释好的一抗,并放入湿盒中,4℃孵育过夜;PBS清洗3次,每次5 min;
12)加入稀释好的荧光二抗,湿盒室温孵育1h;PBS清洗3次,每次5 min;
13)核复染:滴加DAPI,避光孵育5min-10min,PBS清洗3次,每次5 min;
14)用吸水纸吸干多余液体,用抗淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察拍照
4. 体外Brdu标记(组织薄片)
1)Brdu工作液的准备:用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1 mM Brdu工作液。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL组织培养液即得到最终工作液。确保有足够的工作液(37°C温热)完全浸泡组织。
2)用手术刀或者锋利的刀片将组织切割成约1 mm厚,2 mm2大小的薄片。建议在温热的培养基内进行切片,利于维持组织的活力。
3)转移组织薄片至预装有10 mL Brdu标记液的15 mL离心管内。于37°,CO2 培养箱内孵育需要的时间。孵育时间可变,取决于组织薄片类型以及需要达到的实验目的(常用的为2-4 h)。直接丢弃未用完的标记液。
4)37°C PBS清洗组织薄片,每次5 min。
5)使用标准的冰冻切片或者石蜡包埋切片的方法固定组织。
注意事项
1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)该品对肌体有不可逆损伤的可能性。使用时应穿防护服和戴手套。应避免吸入本品的粉尘。
3)本产品仅作科研用途!
HB230216