产品描述
Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for MGI®是用于MGI®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成试剂,以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。
6. 本产品仅作科研用途!
二、关于接头连接(Adapter Ligation)
1. 目前华大智造有2种序号的接头:1-128和501-596。关于其使用要求,请详见华大智造“关于Adapter使用”有关说明或咨询本公司。此外,华大智造申明:2种接头由于设计工艺不同,禁止混用,否则测序数据无法拆分!
2. 我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。
3. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表
Input Total RNA |
Adapter stock concentration |
100–499 ng |
2 μM |
500–4000 ng |
5 μM |
*可根据不同类型total RNA样本及投入量,按需求适当调整Adapter使用量
三、关于文库扩增(Library Amplification )
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。
2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
Input Total RNA |
Number of cycles |
|
Non-stranded |
Stranded |
|
10 ng |
15 |
15 |
100 ng |
14 |
14 |
500 ng |
12 |
13 |
1 μg |
11 |
12 |
【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑,选择最合适的建库条件。
四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。
五、关于文库质检(Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
六、自备材料(Other Material)
1. mRNA富集试剂盒:Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit(Yeasen Cat#12603)。
2. rRNA去除试剂盒:Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。
3. RNA纯化磁珠: Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。
4. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads(A63880)或其他等效产品。
5. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
6. Adapters:详情请咨询华大智造或本公司。
7. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。
8. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
图1 RNA建库操作流程
该步骤是建库前的目标RNA制备,根据建库需求可选择Poly(A) mRNA Isolation方案(方案A)或rRNA Depletion方案(方案B)。Yeasen Cat#13333建库模块不包含该步骤所用试剂,请客户根据建库需要自备相应的试剂。
样本要求
该方案使用Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit(Yeasen Cat#12603)进行mRNA富集。适用于起始模板量为10 ng-4 μg(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。
操作步骤
1. 将mRNA Capture Beads从2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min。
2. 准备一个Nuclease Free离心管,取10 ng-4 μg总RNA,用Nuclease free水将体积补至50 μL,冰上放置备用。
3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。
4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65℃,5 min;25℃,5 min;25℃,hold,完成RNA与捕获磁珠的结合。
5. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。
6. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。
7. 重复步骤6,共洗涤两次。
8. 将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
9. 将样品置于PCR仪中,80℃,2 min;25℃,hold,将mRNA洗脱下来。
10. 将样品从PCR仪中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
11. 室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。
12. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。
13. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回
至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。
【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。
14. 将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如94℃,5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。
表3 mRNA片段化程序推荐
插入片段大小(bp) |
打断程序 |
200-300 |
94°C,10 min; |
300-400 |
94°C,7 min; |
400-500 |
94°C,5 min; |
14. 片段化程序结束后,为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合,请立即将样品置于磁力架中,待溶液澄清后,转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中,立刻进入第一链合成反应(Part 2-Step 1)。
样本要求
该方案使用Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA 中的rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的 1 ng~1 μg (体积≤ 11 μL)总RNA 样品;适用于完整或部分降解 RNA(如 FFPE RNA)样品。
操作步骤
Step 1 探针杂交
1. 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 准备RNA样品:根据投入量和样品浓度,计算RNA取样体积,用Nuclease Free H2O稀释至11 μL。
3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。
表 4 探针杂交反应体系
名称 |
体积(μL) |
Hybridization Buffer |
3 |
Probe Mix(H/M/R) |
1 |
Total RNA |
11(1 ng~1 μg) |
Total |
15 |
4. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
5. 将上述 PCR 管置于PCR仪(可设置梯度降温)中,按照表5所示反应程序,进行探针杂交反应。
表5 探针杂交反应程序
温度 |
时间 |
热盖105°C |
On |
95°C |
2 min |
95°C-22°C |
0.1°C/s |
22°C |
5 min |
4°C |
hold |
Step 2 RNase H消化
1.将RNase H消化试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。按照表 6 所示,配制RNase H消化反应体系。
表6 RNase H消化反应体系
名称 |
体积(μL) |
RNase H Buffer |
3 |
RNase H |
2 |
上步产物 |
15 |
Total |
20 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中,设置反应程序:37°C,30 min; 4°C,hold,进行RNase H消化反应。
Step 3 DNase I 消化
1. 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出,解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。按照表7所示,配制DNase I消化反应体系。
表7 DNase I消化反应体系
名称 |
体积(μL) |
DNase I Buffer |
27.5 |
DNase I |
2.5 |
上一步产物 |
20 |
Total |
50 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中,设置反应程序:37℃,30min; 4℃,hold,进行DNase I消化反应。
Step 4 RNA纯化
1. 准备工作:将 Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H2O配制 80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取 110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner(2.2×,Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中,移液器充分吹打混匀,室温孵育 5 min。
4. 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育 30 sec 后,小心移除上清。
6. 重复步骤 5,总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。
7. 保持 PCR 管始终置于磁力架中,室温下开盖干燥磁珠(5~10 min)。
8. RNA洗脱:将PCR 管从磁力架上取下,加入18.5 μL Frag/Prime buffer,使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置 5 min。
9. 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中,进行RNA片段化。
10. RNA片段化条件需根据样本质量进行调整,高质量的RNA样本,片段化条件可参考mRNA片段化条件(表3)。表8推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异,客户可根据自己的样本情况,做不同片段化条件对比,选择合适的片段化条件。
11. 片段化结束请立即置于冰上,进入一链合成反应(Part 2-Step 1)。
表8 FFPE RNA片段化条件推荐
DV200* |
片段化程序 |
>70% |
94°C,7 min; |
50%~70% |
94°C,5 min; |
20%~50% |
85°C,8 min; |
<20%(风险建库) |
65°C,8 min |
*降解RNA的样本质量使用DV200指标判断,详见附录三说明
Step 1 第一链cDNA的合成(1st Strand Synthesis)
该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案,详见Part 1。
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出,颠倒混匀后瞬离。按表9所示,配制第一链cDNA合成的反应液。
表9 第一链cDNA合成反应体系
名称 |
体积(μL) |
Frag/Prime Buffer with Fragmented RNA |
17 |
Strand Specificity Reagent |
6 |
1st Strand Enzyme Mix |
2 |
Total |
25 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表10所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表10 第一链cDNA合成反应程序
温度 |
时间 |
热盖 105°C |
On |
25°C |
10 min |
42°C |
15 min |
70°C |
15 min |
4°C |
Hold |
Step 2第二链cDNA的合成/末端修复/加A(2nd Strand Synthesis/dA-Tailing):
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表11所示,配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。
表11 第二链cDNA合成反应体系
名称 |
体积(μL) |
1st Strand cDNA |
25 |
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)* |
30 |
2nd Strand Enzyme Master Mix |
5 |
Total |
60 |
【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的Buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的Buffer。
2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表12所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。
表12 第二链cDNA合成反应程序
温度 |
时间 |
热盖 105°C |
on |
16°C |
30 min |
72°C |
15 min |
4°C |
Hold |
Step 3 接头连接(Adapter Ligation)
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的MGI®接头。
1. 参考注意事项二中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。
表13 Adapter Ligation体系
名称 |
体积(μL) |
dA-tailed DNA |
60 |
Ligation Enhancer |
30* |
Novel T4 DNA Ligase |
5 |
DNA Adapter |
5** |
Total |
100 |
【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司接头原始浓度为10 μM, 请根据注意事项二表1的提示,根据投入量对接头进行稀释,使接头添加体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表14所示反应程序,进行接头连接反应:
表14 Adapter Ligation反应程序
温度 |
时间 |
热盖 |
Off |
20°C |
15 min |
4°C |
Hold |
Step4连接产物纯化(Post Ligation Clean Up)
本方案适用于片段<200 bp时,通过两次纯化去除体系中的接头残留;当插入片段≥200 bp时,参照附录二的分选方案,通过纯化、分选获得目标长度的文库。
适用于插入片段<200 bp的文库(需进行两轮纯化)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入52 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取50 μL上清至新PCR管中,再进行一轮纯化。
9. 吸取40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。
11. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
12. 重复步骤11,总计漂洗两次。
13. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
14. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。
Step 5 文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表15中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表15所示反应体系。
表15 接头连接产物PCR反应体系
组分名称 |
体积(μL) |
2×Super Canace® II High-Fidelity Mix |
25 |
Primer Mix for MGI® |
5 |
Adapter Ligated DNA |
20 |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表16示反应程序,进行PCR扩增。
表16 PCR扩增反应程序
温度 |
时间 |
循环数 |
98°C |
1 min |
1 |
98°C |
10 sec |
11~15cycles* |
60°C |
30 sec |
|
72°C |
30 sec |
|
72°C |
5 min |
1 |
4°C |
Hold |
- |
*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整,详见注意事项三。
Step 6 扩增产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。
Step 7 文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。
图2. mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以94°C,10 min、94°C,7min和94℃,5 min处理。打断后mRNA进行进行2.2X 磁珠纯化,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。
【注】:本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,最好优化打断时间。
分选方案适用于94°C,10 min、94°C,7min和94℃,5 min片段化的RNA建库,可以获得插入片段大于200bp的文库:
方案一:接头连接产物纯化后分选
0.6× Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化
1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。
【注】:Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。
双轮分选(以94°C,7min打断,分选文库大小为380bp~480bp为例说明,其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选)
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求,参考表17,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL(0.65×),涡旋或移液器吹打10次混匀。
【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时,若在短接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。
3. 室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液管底。
5. 参考表17向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL(0.15×)。
6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。
7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。
8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。
9. 重复步骤8。
10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3 min)。
11. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。
12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3 min),小心转移20 μL上清至干净管中。
表17 短接头文库分选推荐磁珠比例
插入片段长度(bp) |
200~300 |
300~400 |
400~500 |
500~600 |
文库长度(bp) |
280~380 |
380~480 |
480~580 |
580~680 |
打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
第一轮磁珠体积(ul) |
70(0.7×) |
65(0.65×) |
58(0.58×) |
50(0.5×) |
第二轮磁珠体积 (ul) |
20(0.2×) |
15(0.15×) |
15(0.15×) |
15(0.15×) |
图3. 1ug 293 total RNA,在94°C,10 min、94°C,7min和94℃,5 min片段化后,根据表17推荐的磁珠比例得到的文库大小。
方案二:接头连接产物直接分选(以94°C,7min打断,分选文库大小为410bp~510bp为例说明,其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选)
500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库,推荐直接分选,体系比较粘稠,需要小心添加,RNA质量略差样本可能会有接头残留。
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求,参考表18,的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL(0.20×),涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。
【注】:此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时,若在短接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.1×100 μL=10 μL。
3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移 100 μL上清到干净的离心管中,。
4. 参考表18向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL(0.10×)。
5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置10 min。
6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。
7. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。
8. 重复步骤7。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3 min)。
10. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。
11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3 min),小心转移20 μL上清至干净管中。
表18 短接头文库分选推荐磁珠比例
插入片段长度(bp) |
200~300 |
300~400 |
400~500 |
500~600 |
文库长度(bp) |
280~380 |
380~480 |
480~580 |
580~680 |
打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
第一轮磁珠体积(ul) |
25(0.25×) |
20(0.20×) |
15(0.15×) |
15(0.15×) |
第二轮磁珠体积 (ul) |
10(0.1×) |
10(0.1×) |
10(0.1×) |
10(0.1×) |
1. FFPE RNA质量评价
rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的 Total RNA 样本,但由于不同FFPE样本的质量差距较大,需要根据样本情况调整建库条件。常规评价 RNA 样本质量的参数是 RIN 值,但是对于 FFPE 这种降解的样本,并不能完全用 RIN 值来准确衡量样本的质量,此时还需要用到 DV200指标。DV200 表示样本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例,对于降解严重的 FFPE 样本,DV200值能够更好的反应样本的质量。
DV200计算方法如下:
① 在一个检测完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 结果图中,在 Local 下选择 Advanced
② 勾选 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 选项
③ 选择Region Table页面,鼠标右击,选择Add Region
④ 调整指示线的范围即可得到所选片段范围 所占的比例 % of Total
2. FFPE RNA建库示例
下表展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布,以供参考。对于降解严重的FFPE RNA(DV200<50%)和起始量低的文库构建,我们推荐接头连接后采用两次纯化方案,以减少文库损失。
RNA样本质控 |
建库条件 |
文库分布质控 |
RIN=2.2; DV200=74%
RIN=2.2; DV200=74%
|
投入量:500 ng 片段化条件:94℃,7 min 接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8× 链特异建库扩增:12cycles 文库产量:717.2 ng |
|
投入量:500 ng 片段化条件:94℃,7min 接头连接后进行纯化/分选:0.6×;07×/0.15× 链特异建库扩增:13cycles 文库产量:437.8 ng |
|
|
投入量:100 ng 片段化条件:94℃,5 min 接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8× 链特异建库扩增:15cycles 文库产量: 206.8ng |
|
|
RIN=2.5; DV200=26% |
投入量:500 ng 片段化条件:85℃,8 min 接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8× 链特异建库扩增:12cycles 文库产量:207 ng |
|
投入量:500 ng 片段化条件:85℃,8 min 接头连接后进行纯化、分选:0.6×;0.70×/0.15× 链特异建库扩增:13cycles 文库产量:98.56 ng |
|
|
RIN=2.5; DV200=11% |
投入量:500 ng 片段化条件:65℃,8 min 接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.8× 链特异建库扩增:12cycles 文库产量:354.2 ng |
|
投入量:500 ng 片段化条件:65℃,8 min 接头连接后进行两次纯化:0.6×;0.70×/0.15× 链特异建库扩增:13cycles 文库产量:172.48 ng |
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HB210601