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产品描述
Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含RNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
运输与保存方法
干冰运输。-20℃保存。有效期1年。
注意事项
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
6. 本产品仅作科研用途！
二、关于接头连接 (Adapter Ligation)
1. 本公司可提供长接头 (Indexed Adapter)试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。
目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)。
2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表
|
Input Total RNA |
Adapter stock concentration |
|
10 ng |
1 μM |
|
100 ng |
1.5 μM |
|
500 ng |
3 μM |
|
≥1 μg |
5 μM |
三、关于文库扩增 (Library Amplification)
1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2. 如果您使用 Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用 Index Primers 进行扩增，加上相应的 Index。
3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。
4. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。
表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*
|
Input Total RNA |
Number of cycles |
|
|
Non-stranded |
Stranded |
|
|
10 ng |
15 |
15 |
|
100 ng |
14 |
14 |
|
500 ng |
12 |
13 |
|
1 μg |
11 |
12 |
【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。
四、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。
五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
六、自备材料 (Other Material)
1. mRNA富集试剂盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit (Yeasen Cat#12603)。
2. rRNA去除试剂盒：Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)或其他rRNA去除试剂盒。
3. RNA纯化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。
4. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。
5. RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
6. Adapters：含Index的长接头 (Yeasen Cat#12615~12618)或者无Index的短接头试剂盒 (Yeasen Cat#12414-12415)。
7. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
8. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
建库流程图
图1 RNA建库操作流程
使用方法
Part 1：目标RNA的富集和片段化
该步骤是建库前的目标RNA制备，根据建库需求可选择Poly(A) mRNA Isolation方案（方案A）或rRNA Depletion方案（方案B）。Yeasen Cat#12252建库模块不包含该步骤所用试剂，请客户根据建库需要自备相应的试剂。
方案A：mRNA纯化和片段化 (mRNA Purification and Fragmentation)
样本要求
该方案使用Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit (Yeasen Cat#12603)进行mRNA富集。适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。
操作步骤
1. 将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。
2. 准备一个Nuclease free离心管，取10 ng-4 μg总RNA，用Nuclease Free水将体积补至50 μL，冰上放置备用。
3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。
4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；25℃，5 min；25℃，hold，完成RNA与捕获磁珠的结合。
5. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。
6. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
7. 重复步骤6，共洗涤两次。
8. 将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
9. 将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。
10. 将样品从PCR仪中取出，加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
11. 室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。
12. 将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
13. 将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠，移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。提前准备1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H2O等体积混匀配置，如配置一个反应体系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H2O）
14. 将样品从磁力架上取出，用19 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃），可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如94℃，5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。
表3 mRNA片段化程序推荐
|
插入片段大小 (bp) |
打断程序 |
|
200-300 |
94°C, 10 min |
|
300-400 |
94°C, 7 min |
|
400-500 |
94°C, 5 min |
15. 片段化程序结束后，为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合，请立即将样品置于磁力架中，待溶液澄清后，转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中，立刻进入第一链合成反应 (Part 2-Step 1)。
方案B：rRNA去除与RNA片段化 (rRNA Depletion and RNA Fragmentation)
样本要求
该方案使用Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)去除Total RNA中的rRNA。适用于人、小鼠、大鼠来源的100 ng~1 μg （体积≤ 11 μL）总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。
操作步骤
Step 1 探针杂交
1. 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease Free H2O稀释至11 μL。
3. 按照表4于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。
表4 探针杂交反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
Hybridization Buffer |
3 |
|
Probe Mix(H/M/R) |
1 |
|
Total RNA |
11 (100 ng~1 μg) |
|
Total |
15 |
4. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
5. 将上述 PCR 管置于PCR仪（可设置梯度降温）中，按照表5所示反应程序，进行探针杂交反应。
表5 探针杂交反应程序
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温度 |
时间 |
|
热盖105°C |
On |
|
95°C |
2 min |
|
95°C-22°C |
0.1°C/s |
|
22°C |
5 min |
|
4°C |
hold |
Step 2 RNase H消化
1.将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 6 所示，配制RNase H消化反应体系。
表6 RNase H消化反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
RNase H Buffer |
3 |
|
RNase H |
2 |
|
上步产物 |
15 |
|
Total |
20 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37°C，30 min；4°C，hold，进行RNase H消化反应。
Step 3 DNase I 消化
1. 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表7所示，配制DNase I消化反应体系。
表7 DNase I消化反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
DNase I Buffer |
27.5 |
|
DNase I |
2.5 |
|
上一步产物 |
20 |
|
Total |
50 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50℃；37℃，30min； 4℃，hold，进行DNase I消化反应。
Step 4 RNA纯化
1. 准备工作：将 Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease Free H2O配制 80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取 110 μL Hieff NGS® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。
4. 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H2O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6. 重复步骤 5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。
7. 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。
【注】：提前准备1× Frag/Prime Buffer（用Nuclease Free H2O等体积混匀配置，如配置一个反应体系：9.5 μL 2×Frag/Prime Buffer + 9.5 μL Nuclease Free H2O）
8. RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入19 μL Frag/Prime buffer，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。
9. 将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 17 μL 上清至新的Nuclease free PCR 管中，进行RNA片段化。
10. RNA片段化条件需根据样本质量进行调整，高质量的RNA样本，片段化条件可参考mRNA片段化条件（表3）。表8推荐了FFPE不同质量样本的片段化条件。但不同的样本片段化效果会存在一定的差异，客户可根据自己的样本情况，做不同片段化条件对比，选择合适的片段化条件。
11. 片段化结束请立即置于冰上，进入一链合成反应（Part 2-Step 1)。
表8 FFPE RNA片段化条件推荐
|
DV200* |
片段化程序 |
|
>70% |
94°C, 7 min |
|
50%~70% |
94°C, 5 min |
|
20%~50% |
85°C, 8 min |
|
<20%（风险建库） |
65°C, 8 min |
*降解RNA的样本质量使用DV200指标判断，详见附录三说明
Part 2：RNA文库构建
Step 1 第一链cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)
该步骤将已经富集/片段化的目标RNA合成一链cDNA。目标RNA的富集可根据实验需求和样本情况选择Poly(A) mRNA isolation方案或rRNA Depletion方案，详见Part 1。
1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，颠倒混匀后瞬离。按表9所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
表9 第一链cDNA合成反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
Frag/Prime Buffer with Fragmented RNA |
17 |
|
Strand Specificity Reagent |
6 |
|
2 |
|
|
Total |
25 |
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表10所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表10 第一链cDNA合成反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 105°C |
On |
|
25°C |
10 min |
|
42°C |
15 min |
|
70°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
Step 2第二链cDNA的合成/末端修复/加A (2nd Strand Synthesis/dA-Tailing)：
1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表11所示，配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。
表11 第二链cDNA合成反应体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
1st Strand cDNA |
25 |
|
2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)* |
30 |
|
2nd Strand Enzyme Master Mix |
5 |
|
Total |
60 |
【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的Buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的Buffer。
2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表12所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。
表12 第二链cDNA合成反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 105°C |
on |
|
16°C |
30 min |
|
72°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
Step 3 接头连接 (Adapter Ligation)
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®接头。
1. 参考注意事项二中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表13中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表13所示反应体系。
表13 Adapter Ligation体系
|
名称 |
体积 (μL) |
|
dA-tailed DNA |
60 |
|
Ligation Enhancer |
30* |
|
Novel T4 DNA Ligase |
5 |
|
DNA Adapter |
5** |
|
Total |
100 |
【注】：
*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1的提示，根据投入量对接头进行稀释，使接头添加体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表14所示反应程序，进行接头连接反应：
表14 Adapter Ligation反应程序
|
温度 |
时间 |
|
热盖 |
Off |
|
20°C |
15 min |
|
4°C |
Hold |
Step 4连接产物纯化 (Post Ligation Clean Up)
本方案适用于片段＜200 bp时，通过两次纯化去除体系中的接头残留；当插入片段≥200 bp时，参照附录二的分选方案，通过纯化、分选获得目标长度的文库。
适用于插入片段<200 bp的文库（需进行两轮纯化）
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入52 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取50 μL上清至新PCR管中，再进行一轮纯化。
9. 吸取40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
11. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
12. 重复步骤11，总计漂洗两次。
13. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
14. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。
Step 5 文库扩增 (Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表15中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表15所示反应体系。
【注】：*如果使用的是无Index的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂 (Cat#12414-12415)中配备的Index primer进行扩增。**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#12615~ Cat#12618)，俗称长接头（大Y接头），可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增；
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表16示反应程序，进行PCR扩增。
表16 PCR扩增反应程序
|
温度 |
时间 |
循环数 |
|
98°C |
1 min |
1 |
|
98°C |
10 sec |
11~15cycles* |
|
60°C |
30 sec |
|
|
72°C |
30 sec |
|
|
72°C |
5 min |
1 |
|
4°C |
Hold |
- |
Step 6 扩增产物磁珠纯化 (Post Amplification Clean Up)
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。
Step 7 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。
附录一：mRNA片段化效果展示
图2. mRNA不同打断时间对应的RNA片段范围。分别以94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min处理。打断后mRNA进行进行2.2X 磁珠纯化，通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。
【注】：本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，最好优化打断时间。
附录二：分选条件说明
分选方案适用于94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化的RNA建库，可以获得插入片段大于200bp的文库：
方案一：接头连接产物纯化后分选
0.6X Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化
1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。
双轮分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）
当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时，分选比例参照表17进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化，分选比例参照表18进行。
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表17，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL (0.65×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。
【注】：此表推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时，若在短接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；若在长接头连接之后分选，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL，第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。
3. 室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液管底。
5. 参考表17向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL (0.15×)。
6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
9. 重复步骤8。
10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。
11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
表17 短接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度 (bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度 (bp) |
260~360 |
310~410 |
410~510 |
510~610 |
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打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
80 (0.8×) |
75 (0.75×) |
65 (0.65×) |
60 (0.6×) |
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第二轮磁珠体积 (μL) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
10 (0.1×) |
表18 长接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度 (bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度 (bp) |
320~420 |
370~470 |
470~570 |
570~670 |
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打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
|
第一轮磁珠体积(μL) |
75 (0.75×) |
70 (0.7×) |
65 (0.65×) |
60 (0.6×) |
|
第二轮磁珠体积 (μL) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
15 (0.15×) |
10 (0.1×) |
图3. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表17推荐的磁珠比例得到的文库大小。
方案二：接头连接产物直接分选（以94°C，7min打断，分选文库大小为410bp~510bp为例说明，其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选）
500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库，推荐直接分选，体系比较粘稠，需要小心添加，RNA质量略差样本可能会有接头残留。
当选择短接头（小Y接头）进行连接后纯化，使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414-12415)进行RNA建库时，分选比例参照表19进行，当选择长接头（大Y接头），使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化，分选比例参照表20进行。
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表19，在上述100 μL的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL (0.20×)，涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。
3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移 100 μL上清到干净的离心管中，。
4. 参考表19向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL (0.10×)。
5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置10 min。
6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。
7. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
8. 重复步骤7。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约3 min）。
10. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约3 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
表19 短接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度 (bp） |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
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文库长度 (bp) |
260~360 |
310~410 |
410~510 |
510~610 |
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打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
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第一轮磁珠体积(μL) |
25 (0.25×) |
25 (0.25×) |
20 (0.2×) |
18 (0.18×) |
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第二轮磁珠体积 (μL) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
表20 长接头文库分选推荐磁珠比例
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插入片段长度 (bp) |
200~300 |
250~350 |
350~450 |
450~550 |
|
文库长度 (bp) |
320~420 |
370~470 |
470~570 |
570~670 |
|
打断条件 |
94℃ 10min |
94℃ 7min |
94℃ 7min |
94℃ 5min |
|
第一轮磁珠体积(μL) |
25 (0.25×) |
20 (0.2×) |
18 (0.18×) |
18 (0.18×) |
|
第二轮磁珠体积 (μL) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
10 (0.1×) |
图4. 1ug 293 total RNA，在94°C，10 min、94°C，7min和94℃，5 min片段化后，根据表19推荐的磁珠比例得到的文库大小。
附录二：FFPE样本建库说明
1. FFPE RNA质量评价
rRNA去除建库方案可用于FFPE等低质量的 Total RNA 样本，但由于不同FFPE样本的质量差距较大，需要根据样本情况调整建库条件。常规评价 RNA 样本质量的参数是 RIN 值，但是对于 FFPE 这种降解的样本，并不能完全用 RIN 值来准确衡量样本的质量，此时还需要用到 DV200指标。DV200 表示样本中大于 200nt的 RNA 片段所占的比例，对于降解严重的 FFPE 样本，DV200值能够更好的反应样本的质量。
DV200计算方法如下：
① 在一个检测完成的 Agilent 2100 Bioanalyzer 结果图中，在 Local 下选择 Advanced
② 勾选 Smear Analysis 下的 Perform Smear Analysis 选项
③ 选择Region Table页面，鼠标右击，选择Add Region
④ 调整指示线的范围即可得到所选片段范围 所占的比例 % of Total
2. FFPE RNA建库示例
下表展示了不同质量FFPE样本在不同建库条件下的文库分布，以供参考。对于降解严重的FFPE RNA (DV200<50%)和起始量低的文库构建，我们推荐接头连接后采用两次纯化方案，以减少文库损失。
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RNA样本质控 |
建库条件 |
文库分布质控 |
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RIN=2.2; DV200=74%
RIN=2.2; DV200=74%
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投入量：500 ng 片段化条件：94℃，7 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12cycles 文库产量：717.2 ng |
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投入量：500 ng 片段化条件：94℃，7min 接头连接后进行纯化/分选：0.6×；07×/0.15× 链特异建库扩增：13cycles 文库产量：437.8 ng |
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投入量：100 ng 片段化条件：94℃，7 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：15cycles 文库产量： 206.8ng |
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RIN=2.5; DV200=26% |
投入量：500 ng 片段化条件：85℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12cycles 文库产量：207 ng |
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投入量：500 ng 片段化条件：85℃，8 min 接头连接后进行纯化、分选：0.6×；0.70×/0.15× 链特异建库扩增：13cycles 文库产量：98.56 ng |
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RIN=2.5; DV200=11% |
投入量：500 ng 片段化条件：65℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.8× 链特异建库扩增：12cycles 文库产量：354.2 ng |
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投入量：500 ng 片段化条件：65℃，8 min 接头连接后进行两次纯化：0.6×；0.70×/0.15× 链特异建库扩增：13cycles 文库产量：172.48 ng |
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HB211206
