产品描述

_{Hieff NGS}^®_{96 Single I}_{ndex Primer Kit for Illumina}^®_{, Set 2（48种）是Illumina高通量测序平台文库构建专用试剂盒，共分为2个Set，每个Set包含48种Index Primer。本试剂盒提供了二代测序建库中使用的adapter和单端96种Index Primer，适用于Illumina®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。}

产品组分

_编号	_名称	_规格
_12611ES02	_PE Adapter	_336 μL
	_{Universal Primer}	_240 μL
	_{Index Primer 1-48}	_5 μL each
_12612ES02	_PE Adapter	_336 μL
	_{Universal Primer}	_240 μL
	_{Index Primer 49-96}	_5 μL each

运输与保存方法

_{冰袋运输。}

_{所有组分-20°C保存，有效期18个月。}

注意事项

_{1. 本试剂盒中DNA Adapter的浓度为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。}

_{2. 本试剂盒提供的DNA Adapter为通用型短接头，需要通过PCR扩增获得完整的文库。Index Primer提供Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。}

_{3. 本试剂盒每个Set包含48种Index Primer，每种Index Primer可以构建2个DNA文库，每个Set可以构建96个DNA文库。}

_{4. 切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，建议分装保存，可短暂存放于4℃。}

_{5. 使用Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®试剂盒构建的DNA文库结构如下：}

_{6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7. 本产品仅作科研用途！}

使用方法

_{本试剂盒使用方法按照 Hieff NGS ® MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina® 试剂盒操作说明进行。}

_{接头连接（Adapter Ligation）：}

_{在末端修复产物两端连接特定的Illumina®接头，即Hieff NGS® MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina®操作步骤3.2。}

_{1. 根据Input DNA量按照下表1选择合适的Adapter用量；}

_{表1. 不同Input DNA推荐的Adapter使用浓度}

_{Input DNA}	_{Adapter : Input DNA摩尔比}	_{推荐Adapter(15 μM)使用量}
_400 ng	_30:1	_3.5 μL
_{300 ng}	_40:1	_3.5 μL
_200 ng	_60:1	_3.5 μL
_{100 ng}	_100:1	_3.0 μL
_{50 ng}	_100:1	_1.5 μL

_{【注】：Input DNA 摩尔数（pmol）≈Input DNA质量(ng)/[0.66×Input DNA平均长度（bp）]}

_{2. 将表2中的各种试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用；}

_{3. 配制表2所示反应体系；}

_{表2. Adapter Ligation反应体系}

_名称	_{体积（μL）}
_{dA-tailed DNA}	₆₀
_{Ligation Enhancer}	_30*
_{Quick T4 DNA Ligase}	₅
_PE Adapter	_x**
_ddH2O	_5-x

_{【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时后离心使用。}

_{**本公司接头浓度（Cat#12611；Cat#12612；Cat#12613；Cat#12614）与常规商业化试剂盒一致，皆为15 μmol/L。请根据注意事项三中的提示，计算接头用量。}

_{4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；}

_{5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表3所示反应程序，进行接头连接反应：}

_{表3. Adapter Ligation反应程序}

_温度	_时间
_热盖	_Off
_20°C	_15 min
_4°C	_Hold

_{【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。}

_{连接产物磁珠纯化（Post Ligation Clean Up）}

_{该步骤使用磁珠对连接产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物，分选可筛选特定长度DNA片段以符合测序需要，详细操作步骤参照Hieff NGS® MaxUp DNA Library Prep Kit for Illumina®建库试剂盒说明书。}

_{文库扩增（Library Amplification）}

_{该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集，使用本试剂盒接头时，该步骤为必做步骤；}

_{1. 将表4中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用；}

_{2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应体系；}

_{表4. PCR扩增反应体系}

_名称	_{体积（μL）}
_{2× Super Canace®ⅡHigh-Fidelity Mix}	₂₅
_{Universal Primer}	_2.5
_{Index Primer}	_2.5
_{Adapter Ligated DNA}	₂₀

_{【注】：文库扩增引物来自Yeasen接头引物试剂盒（Cat#12611；Cat#12612；Cat#12613；Cat#12614）。}

_{3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；}

_{4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表5所示反应程序，进行PCR扩增。}

_{表5. PCR扩增反应程序}

_温度	_时间	_循环数
_98°C	_{1 min}	₁
_98°C	_{10 sec}	_{根据实验需要调整}
_60°C	_{30 sec}
_72°C	_{30 sec}
_72°C	_{5 min}	₁
_4°C	_Hold	_-

_序列信息

_{PE Adapter for Illumina：

5´-/5Phos/ GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC -3´

5´-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3´}

_{Universal Primer for Illumina：

5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3´}

_{Index Primer for Illumina：}

_{5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3´}

_{xxxxxxxx表示8 bp 的Index序列，各引物对应的Index名称、引物中包含的Index序列以及测序时对应的Index序列信息如下表所示：}

_{Index Primer名称}	_{引物中Index序列}	_{测序对应Index序列}	_{Index Primer名称}	_{引物中Index序列}	_{测序对应Index序列}
_{Index Primer 1}	_ATCACGTT	_AACGTGAT	_{Index Primer 25}	_TGCGATCT	_AGATCGCA
_{Index Primer 2}	_CGATGTTT	_AAACATCG	_{Index Primer 26}	_TTCCTGCT	_AGCAGGAA
_{Index Primer 3}	_TTAGGCAT	_ATGCCTAA	_{Index Primer 27}	_TAGTGACT	_AGTCACTA
_{Index Primer 4}	_TGACCACT	_AGTGGTCA	_{Index Primer 28}	_TACAGGAT	_ATCCTGTA
_{Index Primer 5}	_ACAGTGGT	_ACCACTGT	_{Index Primer 29}	_TCCTCAAT	_ATTGAGGA
_{Index Primer 6}	_GCCAATGT	_ACATTGGC	_{Index Primer 30}	_TGTGGTTG	_CAACCACA
_{Index Primer 7}	_CAGATCTG	_CAGATCTG	_{Index Primer 31}	_TACTAGTC	_GACTAGTA
_{Index Primer 8}	_ACTTGATG	_CATCAAGT	_{Index Primer 32}	_TTCCATTG	_CAATGGAA
_{Index Primer 9}	_GATCAGCG	_CGCTGATC	_{Index Primer 33}	_TCGAAGTG	_CACTTCGA
_{Index Primer 10}	_TAGCTTGT	_ACAAGCTA	_{Index Primer 34}	_TAACGCTG	_CAGCGTTA
_{Index Primer 11}	_GGCTACAG	_CTGTAGCC	_{Index Primer 35}	_TTGGTATG	_CATACCAA
_{Index Primer 12}	_CTTGTACT	_AGTACAAG	_{Index Primer 36}	_TGAACTGG	_CCAGTTCA
_{Index Primer 13}	_TGGTTGTT	_AACAACCA	_{Index Primer 37}	_TACTTCGG	_CCGAAGTA
_{Index Primer 14}	_TCTCGGTT	_AACCGAGA	_{Index Primer 38}	_TCTCACGG	_CCGTGAGA

_{Index Primer名称}	_引物中 _Index序列	_{测序对应Index序列}	_{Index Primer名称}	_{引物中Index序列}	_{测序对应Index序列}
_{Index Primer 15}	_TAAGCGTT	_AACGCTTA	_{Index Primer 39}	_TCAGGAGG	_CCTCCTGA
_{Index Primer 16}	_TCCGTCTT	_AAGACGGA	_{Index Primer 40}	_TAAGTTCG	_CGAACTTA
_{Index Primer 17}	_TGTACCTT	_AAGGTACA	_{Index Primer 41}	_TCCAGTCG	_CGACTGGA
_{Index Primer 18}	_TTCTGTGT	_ACACAGAA	_{Index Primer 42}	_TGTATGCG	_CGCATACA
_{Index Primer 19}	_TCTGCTGT	_ACAGCAGA	_{Index Primer 43}	_TCATTGAG	_CTCAATGA
_{Index Primer 20}	_TTGGAGGT	_ACCTCCAA	_{Index Primer 44}	_TGGCTCAG	_CTGAGCCA
_{Index Primer 21}	_TCGAGCGT	_ACGCTCGA	_{Index Primer 45}	_TATGCCAG	_CTGGCATA
_{Index Primer 22}	_TGATACGT	_ACGTATCA	_{Index Primer 46}	_TCAGATTC	_GAATCTGA
_{Index Primer 23}	_TGCATAGT	_ACTATGCA	_{Index Primer 47}	_TAGTCTTG	_CAAGACTA
_{Index Primer 24}	_TTGACTCT	_AGAGTCAA	_{Index Primer 48}	_TTCAGCTC	_GAGCTGAA

_{Index Primer名称}	_引物中 _Index序列	_{测序对应Index序列}	_{Index Primer名称}	_{引物中Index序列}	_{测序对应Index序列}
_{Index Primer 49}	_TGTCTATC	_GATAGACA	_{Index Primer 73}	_GCAACATT	_AATGTTGC
_{Index Primer 50}	_TATGTGGC	_GCCACATA	_{Index Primer 74}	_GGTCGTGT	_ACACGACC
_{Index Primer 51}	_TTACTCGC	_GCGAGTAA	_{Index Primer 75}	_GAATCTGT	_ACAGATTC
_{Index Primer 52}	_TCGTTAGC	_GCTAACGA	_{Index Primer 76}	_GTACATCT	_AGATGTAC
_{Index Primer 53}	_TACCGAGC	_GCTCGGTA	_{Index Primer 77}	_GAGGTGCT	_AGCACCTC
_{Index Primer 54}	_TGTTCTCC	_GGAGAACA	_{Index Primer 78}	_GCATGGCT	_AGCCATGC
_{Index Primer 55}	_TTCGCACC	_GGTGCGAA	_{Index Primer 79}	_GTTAGCCT	_AGGCTAAC
_{Index Primer 56}	_TTGCGTAC	_GTACGCAA	_{Index Primer 80}	_GTCGCTAT	_ATAGCGAC
_{Index Primer 57}	_TCTACGAC	_GTCGTAGA	_{Index Primer 81}	_GGAATGAT	_ATCATTCC
_{Index Primer 58}	_TGACAGAC	_GTCTGTCA	_{Index Primer 82}	_GAGCCAAT	_ATTGGCTC
_{Index Primer 59}	_TAGAACAC	_GTGTTCTA	_{Index Primer 83}	_GCTCCTTG	_CAAGGAGC
_{Index Primer 60}	_TCATCCTA	_TAGGATGA	_{Index Primer 84}	_GTAAGGTG	_CACCTTAC
_{Index Primer 61}	_TGCTGATA	_TATCAGCA	_{Index Primer 85}	_GAGGATGG	_CCATCCTC
_{Index Primer 62}	_TAGACGGA	_TCCGTCTA	_{Index Primer 86}	_GTTGTCGG	_CCGACAAC
_{Index Primer 63}	_TGTGAAGA	_TCTTCACA	_{Index Primer 87}	_GGATTAGG	_CCTAATCC
_{Index Primer 64}	_TCTCTTCA	_TGAAGAGA	_{Index Primer 88}	_GATAGAGG	_CCTCTATC
_{Index Primer 65}	_TTGTTCCA	_TGGAACAA	_{Index Primer 89}	_GTGTGTCG	_CGACACAC
_{Index Primer 66}	_TGAAGCCA	_TGGCTTCA	_{Index Primer 90}	_GCAATCCG	_CGGATTGC
_{Index Primer 67}	_TACCACCA	_TGGTGGTA	_{Index Primer 91}	_GACCTTAG	_CTAAGGTC
_{Index Primer 68}	_TGCGTGAA	_TTCACGCA	_{Index Primer 92}	_GCCTGTTC	_GAACAGGC
_{Index Primer 69}	_GGTGAGTT	_AACTCACC	_{Index Primer 93}	_GCACTGTC	_GACAGTGC
_{Index Primer 70}	_GATCTCTT	_AAGAGATC	_{Index Primer 94}	_GCTAACTC	_GAGTTAGC
_{Index Primer 71}	_GTGTCCTT	_AAGGACAC	_{Index Primer 95}	_GATTCATC	_GATGAATC
_{Index Primer 72}	_GACGGATT	_AATCCGTC	_{Index Primer 96}	_GTCTTGGC	_GCCAAGAC

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_短接头	_单端 _{96 Index}	_12611ES02	_{Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1（48种）}	_{48×2 T}	₁₄₉₃
	_单端 _{96 Index}	_12612ES02	_{Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 2（48种）}	_{48×2 T}	₁₄₉₃
	_双端 _{384 Index}	_12613ES02	_{Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 1（96 种）}	_{96×2 T}	₂₇₅₃
	_双端 _{384 Index}	_12614ES02	_{Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 2（96 种）}	_{96×2 T}	₂₇₅₃
_完整接头		_12615ES04/16	_{Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1}	_12×4/ _{12×16 T}	_1256/4526
		_12616ES04/16	_{Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2}	_12×4/ _{12×16 T}	_1256/4536
		_12617ES04/16	_{Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3}	_12×4/ _{12×16 T}	_1256/4536
		_12618ES04/16	_{Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4}	_12×4/ _{12×16 T}	_1256/4536
_Tn5接头		_12610ES96	_{Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®(96 Index)}	_{96 T}	₁₃₆₅

_HB190103

Q:建库接头添加量如何计算？

A: 公式：Input DNA 摩尔数（pmol）≈ Input DNA 质量(ng)/ [0.66 × Input DNA 平均长度（bp）]。

举例：Input DNA 100ng，长度 300bp，那么接头应该添加多少？

根据公式，计算 Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5pmol 根据接头添加比例 100:1，接头摩尔比=100×0.5=50pmol

接头添加量=接头摩尔比（50pmol）÷接头浓度（15μmol/L）=3.34μL 备注：15μmol/L=15pmol/μL

Q:试剂盒中是否包含短接头和 Index primer?

A：内含短接头、通用引物以及index primer，客户如果觉得Index 数目不能满足需求，需自行购买额外的短接头试剂盒。

Q:关于我们接头的交叉污染率以及操作过程中可能引入的污染的问题：

A:我们接头的一个交叉污染率，大概在 0.5%左右，仅供参考；进口接头产品，完整的污染率大概在 1%左右，这里面包含接头原本的污染率（占比更多一些）以及操作中引入的。如果使用 UDI 接头，这个污染率大概可以控制在 0.01%左右的；操作中引入的大概污染率，实验场地、操作人员、枪头、吸取和释放试剂时候导致的微小飞溅等等，所以到目前为止没有固定且有效的方法可以去检测操作引入交叉污染这样一个指标。

Q: 接头连接之后可以直接进行分选吗？

A：不可以，Ligation Enhancer 内含高浓度的 PEG，会对分选造成显著影响，所以接头连接后如果进行片段分选必须先纯化。

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Hieff NGS^® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®,Set 2(48种)

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400-6111-883

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