无缝克隆因具有不受酶切位点限制、可以在质粒的任何位点进行一个或多个DNA片段插入的特点而备受科学家们青睐。Taq DNA ligase作为无缝克隆的关键酶之一，在其中发挥了不可替代的作用。

 

什么是Taq DNA ligase

Taq DNA ligase来源于嗜热菌Thermus thermophilus HB8，是一种耐高温连接酶，以NAD⁺为辅酶因子，在45℃-65℃范围内均有活性。能催化与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5´-磷酸和3´-羟基之间形成磷酸二酯键。该催化反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对，且两条寡核苷酸链之间没有间隙的条件下才会发生。

 

Taq DNA ligase的应用

1.无缝克隆^[1]

2.SNP基因分型检测^[2]

3.全基因合成扩增^[3]

4.NGS建库中nick连接

 

Taq DNA ligase在无缝克隆中的应用

无缝克隆依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，与传统克隆不同的是无缝克隆采用外切酶来产生粘性末端。T5核酸外切酶能够沿着5’→3’方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。但T5外切酶并不能保证每一个片段5’端都会酶切成一样长的粘性末端，退火之后可能会产生缺失的碱基。因此退火之后，无缝克隆中的DNA聚合酶会针对缺失的碱基进行添加，Taq DNA ligase催化碱基之间形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐。

 

 

图1. 无缝克隆原理图

 

翌圣Hieff^® Taq DNA ligase在野生型的基础上进行定向改造，具有更高的连接效率，应用于无缝克隆性能较野生型得到显著提高。

 

性能展示

 

1.超高连接效率

使用翌圣及竞品N*的Taq DNA ligase进行无缝克隆，结果如图2所示，翌圣Hieff^® Taq DNA ligase具有更高的阳性克隆率。

 

图2. 翌圣及N* Taq DNA ligase无缝克隆电泳检测结果

 

 

2.低残留

琼脂糖凝胶电泳检测Hieff^®  Taq DNA ligase无切口酶、外切酶及RNase残留。

 

图3. 切口酶、外切酶及RNase残留检测结果

 

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参考文献

1. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009;6(5):343-345. doi:10.1038/nmeth.1318

2. Li Y, Wark AW, Lee HJ, Corn RM. Single-nucleotide polymorphism genotyping by nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance imaging measurements of surface ligation reactions. Anal Chem. 2006;78(9):3158-3164. doi:10.1021/ac0600151

3. Bang D, Church GM. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat Methods. 2008;5(1):37-39. doi:10.1038/nmeth1136