在同一个实验室中，我们有时会发现，大家用同种细胞、叶片或者动物组织提完RNA后，去进行反转录，得到的cDNA却各有不同。有时候同门师兄弟喜滋滋地做完实验拿到了想要的结果，而我们则会坐在实验台前，因为cDNA质量这一关卡一筹莫展，脑子里时不时飘来一些想法，“差不多的样本和实验，同门师兄弟那么顺，他们是不是欧皇附体了？”“他们不会背着我半夜起床偷偷练习反转录来卷我吧？”……

 

那如何做好反转录，拿到高质量的cDNA，做出漂亮的实验结果呢？细节很重要，小翌这边整理了相关的注意事项和解决方案，分享给大家~

 

1.RNA模板质量

RNA模板质量对于基因的表达分析至关重要， RNA模板质量的评定是反转录中最为关键的一步，实验数据的准确性受RNA纯度和完整度的影响。

分光光度计测定RNA纯度

表1. RNA分析的分光光度计检测指南

分光光度计检测主要用于测定RNA的浓度和纯度，但不能确定RNA的完整度和基因组残留情况。其中，A260/280和A260/230是RNA纯度检测的重要参数，可根据其数值的波动，判断RNA的质量是否满足后续实验。

 

琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整度和纯度

图1.不同质量RNA电泳图

 真核生物的RNA应该有三条带，分别是28S，18S及5S，其中高质量的RNA 28S与18S的条带亮度之比是2：1。若出现条带弥散的现象，则表明RNA已发生降解，需要重新提取RNA。
 

图2.不同纯度RNA电泳图

 泳道上部出现明显的高分子量条带，则表明其中存在gDNA残留；点样孔中若可以观察到比较亮的着色成分时，则表明存在蛋白质残留。

 

2.RNA模板数量

RNA终浓度一致的情况下，后续qPCR中加入相同体积的cDNA产物约等于加入等拷贝的DNA。 
 

表2.反转录体系配制例举

 

以翌圣Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)（Cat #11141）为例，在进行第一步残留gDNA去除时，需对纯度和完整度达标的RNA样本进行计算，得到加入的RNA溶液体积以及对应水的体积（①=1000/RNA浓度，②=15-3-①），以保证后续qPCR时初始等量的cDNA。

 

3.cDNA浓度是否需要检测？

图3.反转录产物体系

 反转录产物是一个混合体系，除了目的产物外，含有剩余的引物、RNA、dNTP、各种蛋白和盐离子成分，这些成分会影响分光光度计检测出来的浓度值，导致cDNA浓度的测定结果意义不大。经实验验证，反转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异，但最终Ct值几乎一致，qPCR检测结果△Ct＜1。

表3. Nanodrop定量结果统计表

 

图4.qPCR检测结果△Ct＜1，且Ct值与 Nanodrop 定量结果无线性关系

 

4.cDNA稀释几倍效果好

实验中Ct值适宜的范围通常在15-35之间，Ct值小于15，则认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值，Ct值大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，判定为无意义。通常完成反转录后，其产物直接用来进行qPCR时，会出现Ct值偏小的情况，这时候需要基于获得的产物进行预实验来确定cDNA的稀释倍数。
 

图5.cDNA模板浓度确认预实验

建议吸取部分cDNA产物稀释3-10倍，选用Ct值落在15-30之间的稀释倍数作为后续实验的cDNA浓度参照。

 

5.结果异常问题解决方案

重复实验中Ct值相比于以往批次结果都要小

同个研究中，有时会出现某一批次生物的重复实验，其内参与目的基因Ct值偏小的情况，该情况往往是由于RNA样本中的gDNA残留造成的。经实验验证，当样本中存在gDNA残留时，Ct值往往会偏小。
 

图6. gDNA对qPCR结果的影响

当出现Ct值偏小时，可选用带有gDNA去除的试剂进行反转录，可消除cDNA产物中gDNA的干扰。

 

Ct值偏大

1）当个别基因Ct值偏大时，可能是由于引物特异性不强或基因丰度较低。鉴定引物特异性时，将cDNA稀释5个梯度做标准曲线，每个梯度设置3个复孔。正常来说，扩增效率应在90~110%之间，如果扩增效率不在正常范围内，建议重新设计2~3对引物，筛选出扩增效率最接近100%的引物。

 

图7. 引物特异性验证实验

 

 若基因本身在样本中丰度低，可提高模板量或者选用高灵敏的qPCR产品。

 2）当所有基因Ct值偏大(内参&目的基因)时，往往是因为RNA模板的浓度和纯度没有达标。建议用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳对RNA模板进行验证，若出现RNA降解，则需要重新提取。

 

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