血管生成实验中基质胶的应用
血管生成（angiogenesis ）会与伤口愈合、炎症、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、黄斑变性和肿瘤生长等存在着密切的关联。在生物体生长过程中，血管生成是新组织生长的重要组成部分。在成年期，除在特殊器官中受到严格调节的周期性事件外，由于促血管生成和抗血管生成内源性因素之间的平衡，几乎每个正常组织都缺乏大量的生理性血管生成。当促血管生成方向的平衡被打乱时，微血管内皮细胞 (EC) 会转变为血管生成表型，从而开始血管生成反应，该反应可以被消除或加速。
在研究过程中所涉及到血管生成实验，传统的体内血管生成实验方法有：角膜微袋、肠系膜、海绵/基质植入物、圆盘分析 (DAS)、斑马鱼等。但这些实验不仅技术要求高，成本昂贵，耗时长，还会涉及到道德伦理问题等。相较于体内做血管生成实验，在体外利用特殊基质维持细胞生成血管是一种比较经济和实用的实验[1]，其中最常用的细胞生长维持基质物就是来源与EHS小鼠肿瘤中提取出的可溶性基底膜制备物——基质胶。
基质胶主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等组成，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子。为组织和细胞提供支撑、抗拉强度和支架支撑，也可以作为细胞粘附和运动的三维亚结构以及生长因子、趋化因子和细胞因子的储存库，同时可作为细胞形态发生和分化的信号等。翌圣生物开发生产的Ceturegel®基质胶不含LDEV（乳酸脱氢酶增高病毒），超低内毒素含量，并全部经过支原体检测保证无支原体污染，包括基本浓度、高浓度、低生长因子等不同类型基质胶。
安全性高：不含LDEV（乳酸脱氢酶增高病毒）
浓度多样性：浓度范围在8~20 mg/mL之间
批次稳定性好：严格生产质检过程保证批次间性能稳定
低内毒素：内毒素含量≤4 EU/mL
污染物检测： 经检测无支原体和细菌、真菌残留
单批产量高：单批产量在L级别以上
兼容性好：可与任何类型的细胞培养基兼容
实验步骤
01 基质胶准备
1.实验前一天，从冷冻冰箱内取出Ceturegel®基质胶并置于4℃冰箱过夜融化，同时对所使用的耗材预冷处理。
2.实验前将Ceturegel®基质胶始终放置在冰盒中。
3.打开血管生成载玻片灭菌包装，取出载玻片。
4.向每孔内加入10 μlCeturegel®基质胶，注意加入Ceturegel®基质胶时枪头要垂直于内孔的正上方，防止有基质胶流经上孔而留下残胶。
02 凝胶
1.首先盖上载玻片的盖子，准备一个10 cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。
2.将载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。
3.将整个培养皿放入CO2培养箱中，静置30min左右等待胶凝结，同时准备细胞悬液。
03 细胞铺板
1.将消化后的细胞制备成密度为2*105 cells/ml细胞悬液，充分混匀。
2.将含有已经凝固成胶状的血管载玻片取出。
3.每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。
4.加入细胞培养基，盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在基质胶的表面。
04 图像采集
按照细胞生长速度定时观察拍照、留存图像。
免疫荧光染色（选做）
1.小心移除孔内培养基，切勿碰触胶或者细胞网络。用无血清培养基稀释钙黄绿素使其终浓度为6~8 µg/ml。
2.加入细胞染液使其完全浸没细胞，室温，避光孵育30~40分钟。
3.PBS清洗三次，注意PBS要缓缓加入上孔，以免冲击掉细胞。
4.使用Ex=485 nm，Em=529 nm波长进行荧光观察
05 结果统计
并对其成管长度、覆盖面积、成环数、结点数进行测量和记录，并进行统计分析。
图：血管生成结果图
图：血管免疫荧光染色图[2]
01 拿到的基质有色差的变化（淡黄色到深红色）是什么原因？
对于含酚红的基质胶主要原因是由于酚红和碳酸氢盐与CO2作用引起的，但是与5％CO2平衡后色差即会减少。冻融后，轻轻摇晃试剂瓶使基质胶分散均匀。
02 基质胶的操作要注意哪些事项？
所有操作需在无菌环境下进行，应使用预冷的移液器以保证基质胶呈匀浆状。
03 基质胶的如何分装冻存使用？
可将冻融后的Ceturegel®基质胶分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。所有涉及到使用的物品在使用前需预冷，使用预冷的移液管、吸头及小管等操作基质胶。
[1] Norrby K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep;10(3):588-612. doi: 10.1111/j.1582-4934.2006.tb00423.x.
[2] Benton G, Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Koblinski J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 2014 Dec 15;79-80:3-18. doi: 10.1016/j.addr.2014.06.005.
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产品类型 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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基本浓度 |
40183ES08/10 |
5/10 mL |
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40184ES08/10 |
5/10 mL |
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低生长因子 |
40185ES08/10 |
5/10 mL |
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40186ES08/10 |
5/10 mL |
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高浓度 |
40187ES08/10 |
5/10 mL |
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Ceturegel® Matrix High Concentration,Phenol Red-Free,LDEV-Free 基质胶 |
40188ES08/10 |
5/10 mL |
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40189ES08/10 |
5/10 mL |
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干细胞专用 |
40190ES08/10 |
5/10 mL |
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类器官专用 |
Ceturegel® Matrix for Organoid culture,Phenol Red-Free,LDEV-Free 基质胶 |
40191ES08/10 |
5/10 mL |
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