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细胞激活剂──钙离子载体离子霉素 Ionomycin


离子霉素(Ionomycin),一种来源于Streptomyces conglobatus的聚醚类窄谱抗生素,是一种有效的钙离子载体,高度选择性结合钙离子,也能转运其他离子,但亲和力相对较低(Ca2+ >Mg2+ >>Sr2+=Ba2+)。Ionomycin通过直接刺激钙池调控钙内流,提高胞内钙离子水平。Ionomycin常用的有效浓度为:1-10 μM。

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图1 离子霉素游离酸分子结构式(CAS NO: 56092-82-0)

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图2 离子霉素钙盐分子结构式(CAS NO: 56092-82-1)

在细胞内,Protein kinase C (PKC)的激活,可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致多种蛋白的表达,进而引起细胞的活化。PKC可以在DAG(二脂酰甘油)和Ca2+共同作用下被激活。Ionomycin常与PKC激活剂PMA联用,刺激免疫细胞活化,同时也加入蛋白转运抑制剂(通常是Monensin或Brefeldin A)阻止高尔基体将新分泌蛋白运输到细胞外,以增强细胞内细胞因子的检测。如果是对分泌蛋白进行免疫检测(例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测),则无需使用Monensin或Brefeldin A对细胞进行处理。

PMA和Ionomycin活化免疫细胞产生细胞因子步骤(用于流式检测)

1、试剂准备

① Ionomycin, 0.5 mg/mL用纯乙醇配制。分装为20 μL/管,–20°C可保存6个月。

② Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/mL用DMSO配制。分装为20 μL/管,–20°C可保存6个月。

2、无菌条件下从健康人的外周血中分离PBMC。

① 用无菌PBS按照1:1稀释全血;

② 加入等体积的Ficoll-Paque,室温下400× g离心20-30 min;

③ 收集交界处的PBMC,加入无菌PBS,4°C下300× g 离心5 min,丢弃上清液,重复两次洗涤细胞;

④ 加入RPMI 1640完全培养基重悬细胞,继续培养;

3、PMA/Ionomycin刺激细胞

收集细胞计数,用新鲜培养基重悬至细胞密度为1~2×106 cells/mL,加入PMA (10 ng/mL)和Ionomycin (1 μg/mL)混匀,37 ℃ 5% CO2培养4~6 h(不要超过6 h)

注:根据实验需求,选择是否需要加入蛋白转运抑制剂Monensin或Brefeldin A。

4、4°C下300× g 离心5 min,去除上清,收集细胞进行流式细胞染色,检测细胞因子表达情况(如IFN-γ、IL-2、TNF-α等)。

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货号

产品名称

50401ES

Ionomycin,Calcium Salt 离子霉素,钙盐

50402ES

Ionomycin,Free Base 离子霉素,游离酸

50601ES

PMA(TPA) 佛波肉荳蔻醋酸

50501ES

Monensin Solution(1,000×) 莫能霉素溶液(1,000×)

50502ES

Brefeldin A(BFA,5 mg/mL) 布雷非德菌素A

 

已发表文章(部分)

[1] Zhao M, Duan N, et al. CD5+ B lymphocytes secrete IL-10 rather than TGF-β1 which control the immune response in autoimmune haemolytic anaemia/Evans syndrome. Autoimmunity. 2019 Feb;52(1):12-20.  PMID: 30784322 IF: 2.5

[2] Chen R, Ning Y et al. The miR-193a-5p/NCX2/AKT axis promotes invasion and metastasis of osteosarcoma[J]. J Cancer. 2021 Aug 8;12(19):5903-5913. PMID: 34476004 IF: 3.932

[3] Xu S, Cheng X, et al. Capsaicin induces mitochondrial dysfunction and apoptosis in anaplastic thyroid carcinoma cells via TRPV1-mediated mitochondrial calcium overload. Cell Signal. 2020 Nov;75:109733. PMID: 32771398 IF: 4.132

[4] Ma H, Tan Y, Wen D, et al. DC-CTL targeting carbonic anhydrase IX gene combined with iAPA therapy in the treatment of renal cell carcinoma. Hum Vaccin Immunother. 2021 Nov 2;17(11):4363-4373. PMID: 34851805 IF: 3.059