胰蛋白酶(Trypsin, EC3.4.21.4)，又称胰酶，是从牛、羊、猪的胰脏中所提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，在脊椎动物中作为消化酶而起作用。胰酶是由223个氨基酸组成的单链多肽，包括两个亚基，α亚基（有2个多肽链构成）和β亚基（有1个多肽链构成），特异性切割带正电荷赖氨酸和精氨酸羧基端，但当这两个氨基酸紧连脯氨酸或切割位点任一边紧邻酸性残基时，会减缓胰酶水解速率。

图1 胰蛋白酶分子结构式(CAS NO. 9002-07-7)

由于胰酶可以作用跨膜蛋白和胞外基质中的蛋白质，如：钙粘素、整联蛋白等，胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等，故胰酶现常用于解离组织和单层细胞。虽然胰蛋白酶能使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，但不同的组织或者细胞对胰酶的反应是不一样的，分散细胞的活性还与胰酶浓度、反应温度和时间有关。在pH条件为7-9、温度为37℃的条件下是胰酶分散细胞的作用能力最强，将EDTA添加到胰蛋白酶溶液中作为螯合剂，用于中和Ca2⁺和Mg2⁺以防止其抑制胰蛋白酶活性。此外，胰酶水解活性可被多种抑制剂抑制，包括：1）有机磷化合物，如氟磷酸异丙酯；2）来源于胰腺、大豆、青豆、蛋清的天然胰蛋白酶抑制剂；3）银离子；4）特定蛋白酶抑制剂，如AEBSF、抗蛋白酶、抑肽酶、DFP、亮抑肽酶、PMSF、TLCK等。

胰酶应用于贴壁细胞

实验过程

1、移除细胞培养液，用不含Ca2⁺和Mg2⁺的无菌PBS、Hanks液或无血清培养液润洗贴壁细胞，去除残余血清；

2、加入适量胰蛋白酶溶液至完全覆盖细胞，室温孵育几分钟，不同的细胞消化时间有所不同，对于贴壁牢固的细胞可适当延长消化时间。不同的细胞消化时间有所不同，对于贴壁牢固的细胞可适当延长消化时间。

3、细胞显微镜下观察，有明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化，加入含血清的细胞培养液终止消化。注意避免过度消化，防止胰酶对细胞造成的损伤。

4、轻轻反复吹打将细胞从培养板底尽可能吹离，收集至无菌离心管；

5、室温500 g离心5min后收集沉淀细胞进行下一步操作或将细胞冻存；

注意事项

1、使用胰酶时应把握好浓度、温度和时间，以免因消化过度对细胞造成损伤。

2、配置胰酶溶液时应选用不含Ca2⁺和Mg2⁺的HBSS，以免降低胰酶的活性。

3、建议用含有血清培养液来终止胰酶对细胞消化作用。

4、胰酶溶液不宜4℃长期保存，切忌反复冻融，建议分装冻存。

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图2 Yeasen胰蛋白酶产品

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