蛋白质修饰之——泛素化修饰
蛋白质的修饰有多种类型，除了常见的无机和有机小分子修饰，如磷酸化、糖基化、脂酰化等，还有一类用小肽进行修饰的，例如泛素化（ubiquitination），类泛素化NEDD化（neddylation）、ISGylation苏木化（SUMOylation）等。而泛素-蛋白酶体系统则负责特异性地降解大多数细胞内蛋白（约占 80% 以上），是一种高效蛋白降解途径。泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位，调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。
泛素-蛋白酶体系统组成
泛素-蛋白酶体系统（UPS）包括：泛素、泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3，26S蛋白酶体以及去泛素化酶。
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组成 |
种类特点 |
实际意义的研究方向 |
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泛素 |
由76个氨基酸组成的多肽，共有7个赖氨酸残基，广泛存在于真核生物,原核生物中尚未发现，泛素的氨基酸序列极其保守。 |
7个赖氨酸突变位点的研究，如K48,K63残基发生突变功能就会受到影响 |
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泛素活化酶E1 |
目前发现2种主要是UBA1,UBA6 |
UBA1比较热门 |
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泛素结合酶E2 |
目前共发现约50种 |
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泛素连接酶E3 |
目前共发现泛素连接酶E3（约500~800种） |
1、PINK1/Parkin 通路中，Parkin 蛋白具有 E3 泛素连接酶。 2、MDM2发挥类似抑癌蛋白P53泛素化降解E3作用。 3、锌指蛋白91（ZFP91）是一种非典型 E3 泛素蛋白连接酶，可介导 MAP3K14/NIK 的“Lys-63”连接泛素化，从而稳定和激活 MAP3K14/NIK。 |
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蛋白酶体 |
在生物细胞体内普遍存在的是26s蛋白酶体，它的组成分为两部分，20s蛋白酶体，是核心的成分；19s蛋白酶体，起调节作用。 |
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去泛素化酶 |
100 多种去泛素化酶（DUBs） |
USP30成为调控线粒体自噬的帕金森治疗靶点 |
泛素分子结构 图片来源：维基百科
蛋白质泛素化降解的途径
靶蛋白的泛素化降解是经过几个连续的过程来完成的，主要分为五步：
① E1类酶激活泛素，该过程需要ATP（三磷酸腺苷）提供一定能量；
② 泛素激活酶E1将活化的泛素分子传递给E2类酶；
③ 泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到靶蛋白上；
④ 被标记的蛋白质分子尾端形成一小段泛素分子链；
⑤ 26s蛋白酶体特异性地识别这个带有泛素标签的底物蛋白，将其降解掉。
泛素化过程 图解来源：维基百科
总的来说，靶蛋白是在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的依次作用下共价连接上几个泛素分子，最后被26s蛋白酶体特异性地识别并降解成小肽，泛素在去泛素连接酶的作用下进行回收利用，这些小肽再被细胞质中的蛋白酶降解为氨基酸。
26S 蛋白酶体降解泛素化标记的蛋白质
泛素-蛋白酶体途径发现具有划时代意义
泛素-蛋白酶体系统（UPS）可以控制特定蛋白质的寿命，从而调节多种细胞功能，是生命科学领域重要的发现。由于这一发现2004年诺贝尔化学奖被授予以色列理工学院的亚伦·西查诺弗（Aaron Ciechanover）和阿夫拉姆·赫什科（Avram Hershko），以及美国加州大学的欧文·罗斯（Irwin Rose）三位科学家。
研究方向
◆ 细胞周期控制：细胞周期进程是由一系列细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）来进行调控的，而 CDK 则是由细胞周期蛋白（cyclin）来激活。在 CDK-cyclin 复合物行使了它的功能之后，复合物中的 cyclin 就会被多泛素化并由蛋白酶体降解，从而保证了细胞周期的正常运转。当蛋白质裂解作用发生异常时，人体就会产生不适甚至疾病，（如子宫颈癌症和囊肿纤维症等）。
◆ 肿瘤药物研究：蛋白酶抑制剂可以诱发处于快速分裂中的细胞（如癌细胞）的凋亡，因此一些蛋白酶抑制剂已经被开发并作为化疗药品被用于治疗癌症，硼替佐米是第一种用作化学治疗药物的蛋白酶体抑制剂。主要被用于多发性骨髓瘤的治疗，在治疗B细胞相关癌症的临床前和早期临床研究特别是一些类型的非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）有显著效果。
◆ 调控植物生长：茁长素（auxin）或植物激素（phytohormone）的作用是调控植物生长的方向和向性，它们通过细胞信号通路来诱导一系列转录因子抑制蛋白（Aux/IAA 蛋白）进入蛋白酶体降解途径。
◆ 细胞应激反应：当细胞应激（如感染、热休克以及氧化损伤）反应发生时，热休克蛋白被大量表达，其作用是识别错误折叠或去折叠的蛋白质，并标记它们以供蛋白酶体降解。
◆ 晚发型神经退行性疾病新靶点：阿尔兹海默症（AD）、帕金森病（PD）代表性的有 PINK1/Parkin 通路。在 PINK1/Parkin 通路中，Parkin 蛋白具有 E3 泛素连接酶活性，新的 PD 治疗方法聚焦于增强线粒体泛素化或抑制去泛素化，如激活 Parkin 蛋白，或抑制去泛素化酶 USP30。
◆ 免疫系统中的作用：蛋白酶体被认为与炎症反应和自身免疫性疾病相关。蛋白酶体活性水平的提高与包括牛皮癣、哮喘、红斑性狼疮和类风湿性关节炎在内的自身免疫性疾病相关。
如何检测蛋白是否泛素化
1. 免疫印记、免疫沉淀
通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来（其中包括被泛素化修饰的蛋白）。分离出来的蛋白再进行SDS电泳，使用泛素抗体western blot分析。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个发生了泛素化修饰。可以初步判断某蛋白具有泛素化功能；
2. 体外泛素标记突变位点实验
将我们要研究的蛋白（被泛素化的蛋白），通过蛋白提取试剂盒提取内源性蛋白或者通过基因工程技术重组表达后提纯。在体外与K63-orK48-linked ubiquitin chain petides一系列酶，E1,E2,E3在适合条件下孵育，然后通过western blot并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。
3. 体外泛素化实验
在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的蛋白）与UBE1，Ubc13和UBE2V2 complex，Tag-ubiquitin以及我们要研究的蛋白B（具有泛素连接酶E3活性），共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。这一方法可以明确引起B蛋白是引起A蛋白发生泛素化修饰的且具有E3连接酶活性。
4. 实验步骤
（1）反应体系配制：
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名称 |
体积（20 μL） |
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10 × Reaction Buffer |
2 μL |
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E1 Enzyme（0.5μg/μl=4.23μM） |
1 μL |
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Ubiquitin（冻干粉） |
2-4μL（0.588mM） |
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10 × Mg2+-ATP |
2 μL |
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E2 Enzyme |
1 μL |
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E3 Ubiquitin Ligase* |
0.2-2 μM |
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Substrate (可选)* |
1-5 μM |
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H2O |
Up to 20 μL |
准备好E3 Ubiquitin Ligase （可重组表达或从细胞裂解液中纯化），Substrate (可选)不能检测底物蛋白自泛素化。
（2）反应条件：37℃孵育 （30min-2h），建议使用 PCR 仪或金属浴
（3）结果检测：
取样品 20 μL 加入 5 μL 的 5× SDS-PAGE Buffer（加入 1 μL 新鲜配制的 1M DTT），加热样品 95℃ 5 min，随后使用还原性（含 DTT）上样缓冲液进行 SDS-PAGE 电泳分析;
选择 E3 Ubiquitin Ligase、泛素、Substrate 抗体进行 Western-blot 分析。
如上图泳道2，4，6实验组，底物蛋白均被泛素化
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