☆在完整的RNA和降解的RNA样本中，检测的基因的Ct值是稳定的吗？

☆如果基因表达差异倍数不大，与RNA降解有关吗？

☆内参基因的作用：降低RNA降解对qPCR的影响

☆引物的选择：扩增合适大小的目的片段

 

基因定量包含逆转录和定量PCR，获得高纯度、降解程度低的RNA，对于其后的反转、定量结果，自然是非常重要的。

 

一、RNA完整性（RNA integrity）

RNA的降解程度可根据RIN值来评定，该值由Aligent 2100仪器测定。将RNA完整性分为10级，用数字1、2、3……8、9、10表示。RIN值越接近10，RNA完整性越好；RIN值越接近1，RNA降解越严重。

 

 

就降解程度而言，来源于组织的RNA较细胞严重。RNA完整性与样本的组成（内源性RNase含量）、保存、处理过程（处理难易程度）、处理时间（处理速度）有关。较坚硬、较难处理的样本（如瘤胃、空肠），获得的RNA的RIN值越小，且不同样本间重复性差。

 

二、RNA发NA发生降解后，qPCR定量的Ct值变大

Corpus luteum来源的RNA经酶消化处理或紫外线照射，获得不同降解程度的RNA。之后，对18S rRNA、28S rRNA、β-actin及IL-1β定量。

 

 

我们可以看到：

1、不论是高丰度表达基因（18S rRNA、28S rRNA、β-actin）或低丰度表达基因（IL-1β），RNA降解程度越高，Ct值越大；RNA完整性越好，Ct值越小。

2、RNA质量越好，Ct值波动越小，qPCR实验的重复性也越好。

 

三、RNA发生降解后，定量结果不可控

进行基因表达量分析时，可通过选择内参基因尝试消除样本间模板量的差异。RNA的降解可认为是RNA“稳态”的变化，引入内参基因校正样本不同降解程度的差异。那么经内参（β-actin）校正后的基因（18S rRNA、28S rRNA、IL-1β）的qPCR检测结果即△Ct值变化情况如何呢？

 

 

可以看出：

1、内参基因（β-actin）校正后，RNA降解前后，△Ct值变化较Ct值变化小。

2、经内参基因校正后，对于一些基因（28S rRNA），RNA降解前后，△Ct值依旧会出现“小的”变化。

 

因此，RNA模板发生降解，利用相对定量PCR可以定量基因表达的趋势，而进行精确定量需谨慎！因此，基因表达差异倍数不大时，需评估RNA质量。

 

四、从RNA完整性角度解释：qPCR定量，扩增产物长度最好控制在70-250bp

RNA降解程度与qPCR扩增基因的长度呈现一定的关系：70-250bp，RNA完整性越高，Ct值越小，呈现线性关系。而＞400bp，RNA完整性与Ct值之间无明显相关性。因此，RNA模板发生部分降解，对于＞400bp以上的目的基因，无法利用相对定量进行定性分析。

 

 

RNA发生降解，会影响qPCR的Ct值，导致定量数据的重复性差。即使使用内参基因校正，依旧会造成定量结果出现误差，不能精确反应样本间的基因表达量的差异。但是当降解不严重时，还是可以用于基因的定性分析。 

小编码了这么多字，其实就是想说“作为模板的RNA，它的完整性对于做好qPCR实验很有意义”，毕竟RNA是容易降解的。

 

参考文献

1.Schroeder A; Mueller O; Stocker S; Salowsky R; Leiber M; Gassmann M; Lightfoot S; Menzel W; Granzow M; Ragg T. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements[J]. Bmc Molecular Biology, 2006, 7(703):3-3.

2.Fleige S, Walf V, Huch S, et al. Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCR.[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28(19):1601-1613.

3.Simone Fleige,Michael W,Pfaffl,et al. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance[J].Molecular Aspects of Medicine,2006,(27) 126–139.

4.Joëlle V, Katleen D P, Steve L, et al. Measurable impact of RNA quality on gene expression results from quantitative PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2011, 39(9):e63-e63.