核酸提取—我们是认真的
核酸提取大致分为3大部分：破碎、提取、纯化。核酸提取是其中很重要的一个环节，核酸模板的质量很大程度上决定了下游PCR检测结果的准确性。在目前的分子诊断实验室当中，磁珠法提取和硅胶膜离心柱法提取是最常用的两种提取方法。那么，这两种提取方法各有什么特点？提取流程与原理又是什么呢？
柱式篇
硅胶膜离心柱法原理：硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。当溶液中存在一定浓度的阳离子后，形成的阳离子桥能够中和DNA和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使DNA牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与DNA磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放DNA。
硅胶膜离心柱法核酸提取流程：
硅胶膜离心柱法提取特点：
1、实验流程操作简单
2、价格低廉
3、提取浓度效果好，浓度高。
翌圣生物根据不同样本的提取方法提供了不同的产品选择：
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分类 |
样本类型 |
产品名称/货号 |
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多类型样本 |
动物细胞、组织、常规植物样本 |
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各类液体样本 |
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医疗样本 |
细胞、组织 |
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血液、血清、血浆 |
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拭子类 |
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医疗样本中及培养物中的病毒 |
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植物样本 |
常规植物样本 |
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细菌样本 |
细菌培养物 |
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真菌样本 |
真菌培养物 |
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宏基因组样本 |
土壤中的全微生物 |
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粪便中的全微生物 |
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质粒样本 |
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DNA产物 |
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Yeasen柱式核酸提取试剂盒数据展示：
1.MolPure® Cell/Tissue DNA Kit 细胞/组织DNA提取试剂盒（18700ES）
适用样本类型
各类动物的肝脏、肌肉等脏器或培养细胞
产品特点
得率高：产量高达40 µg
DNA纯度高：无蛋白质和RNA污染，可直接用于PCR、酶切和杂交等实验
快速简便：无需传统乙醇沉淀标准操作，全程30min可完成单个样本核酸提取
安全环保：无需使用酚、氯仿等有机物抽提
下游应用
动物基因型鉴定、基因克隆等
应用案例
MolPure® Cell/Tissue DNA Kit可用于小鼠基因组提取
取等量的小鼠不同组织，使用MolPure® Cell/Tissue DNA Kit和T品牌同类产品提取基因组DNA，50 μL ddH2O洗脱。并取1 μL洗脱液作为模板，进行扩增实验。结果显示，MolPure® Cell/Tissue DNA Kit提取产量高，提取产物对下游扩增实验无干扰，可有效扩增4 kb基因。
图1. 琼脂糖电泳判定提取的基因组产量
图2. 琼脂糖电泳检测小鼠2 kb和4 kb的扩增条带
2.MolPure® Plant DNA Kit 植物DNA提取试剂盒（18800ES）
产品信息
MolPure® Plant DNA Kit采用MolPure® DNA Column P1和新型的溶液体系。提取过程不需要用到有毒的酚、氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀。操作简便，可在30 min内完成植物样品（100 mg新鲜植物组织或20 mg干燥植物样本）的DNA提取和纯化工作。试剂盒内的MolPure® DNA Column P1可选择性吸附核酸，不吸附蛋白质、多糖和其它非核酸类物质，得到的DNA纯度高，可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。
适用样本类型
拟南芥、小麦、水稻、大豆、玉米、烟草、棉花等植物叶片、根茎、种子等；不建议用于复杂多糖多酚，次级代谢产物多的植物
产品特点
适用性广：可从多种植物样品中提取基因组DNA
DNA纯度高：无蛋白质和RNA污染，可直接用于酶切、PCR、文库构建等实验
快速简便：操作过程30 min即可完成
安全环保：无需使用酚、氯仿等有机物抽提
下游应用
基因型鉴定、基因克隆等
应用案例
MolPure® Plant DNA Kit可用于植物基因组提取
取100 mg的拟南芥和杨树树叶，使用MolPure® Plant DNA Kit和T品牌同类产品提取基因组DNA，50 μL ddH2O洗脱。并取1 μL洗脱液作为模板，进行扩增实验。结果显示，MolPure® Plant DNA Kit提取产量高，提取产物对下游扩增实验无干扰，可有效扩增4 kb基因。
图1. 琼脂糖电泳判定提取的基因组产量
图2. 琼脂糖电泳检测拟南芥和杨树2 kb和4 kb的扩增条带
3.MolPure® Soil DNA Kit 土壤DNA提取试剂盒（18815ES）
产品信息
MolPure® Soil DNA Kit适用于各类土壤样品中核酸的提取。样本预处理采用陶瓷珠和二氧化硅颗粒混合而成的玻璃珠，可有效处理真细菌孢子和内生孢子，革兰氏阳性细菌，酵母，藻类，线虫和真菌等土壤中的各类微生物。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，配合本公司独特的裂解液配方可以可在40 min内最大限度的回收高纯度核酸。提取的DNA纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种下游应用实验，如酶切、PCR等实验。
适用样本类型
土壤
产品特点
提取效率高：采用陶瓷珠和二氧化硅颗粒混合而成的玻璃珠高效裂解、释放土壤中的微生物DNA；
纯度高：下游应用不受抑制。
应用案例
MolPure® Soil DNA Kit可用于土壤微生物菌群分析
取4份500 mg河道土壤，使用MolPure® Swab DNA Kit和M品牌同类产品提取基因组DNA，50 μL ddH2O洗脱。并分别取等体积洗脱液和等质量的DNA作为模板，扩增大肠杆菌16s rDNA实验。结果显示，MolPure® Swab DNA Kit提取产物纯度高，对下游扩增实验无干扰。
图1. 琼脂糖电泳检测大肠杆菌16s rDNA的扩增条带
（注：阳性对照为培养的大肠杆菌gDNA；Y1/Y2和M1/M2为1 μL洗脱液，M3/M4为M1/M2稀释3倍后的洗脱液）
4.质粒DNA提取产品选择指南
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产品名称/货号 |
起始菌液量 |
提取产量 |
质粒内毒素含量 |
下游应用 |
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MolPure® 质粒小量提取试剂盒（19001ES） |
2-4 mL |
5-20 µg |
- |
分子克隆、酶切、测序文库构建 |
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MolPure® 无内毒素质粒小量提取试剂盒（19021ES） |
1-10 mL |
20-50 µg |
<0.1 EU/μg DNA |
转染、酶切、转化、PCR、体外转录、测序 |
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MolPure® 无内毒素质粒大量提取试剂盒（19036ES） |
150-300 mL |
0.5-2 mg |
<0.1 EU/μg DNA |
产品特点
提取产量高、操作简单快速
应用案例
MolPure® 质粒提取试剂盒提取产量高、内毒素残留量低
取150 mL不同大小的质粒，使用MolPure® 无内毒素质粒大量提取试剂盒和T品牌同类产品提取质粒DNA，1 mL ddH2O洗脱。并取等体积量的洗脱液，跑胶鉴定条带亮度和内毒素残留检测。结果显示，MolPure® 无内毒素质粒大量提取试剂盒提取质粒产量高，内毒素残留低于<0.1 EU/μg DNA。
图1. 琼脂糖电泳判定提取的2.6 kb、40 kb及5.7 kb质粒产量
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阴性对照 |
阳性对照 |
Y1-pUC19 |
T- pUC19 |
Y1-40 kb |
T-40 kb |
Y1-pSET152 |
T-pSET152 |
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545 nm吸光度值 |
0.1 |
1.9749 |
2.3596 |
2.3307 |
2.3246 |
2.3134 |
2.3989 |
2.144 |
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内毒素浓度（EU/μg DNA） |
0.0012 |
0.0017 |
0.0011 |
0.0014 |
0.0011 |
0.0016 |
表1. 内毒素含量测定
5.MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 细胞/组织总RNA提取试剂盒
产品信息
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit适用于从多种新鲜或冻存的动物组织或培养细胞中高效率地提取高纯度、高质量的总RNA。提取过程不需要用到有毒的酚、氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀。操作简便，30 min即可完成动物组织或细胞（10-20 mg动物组织或(1-5)×106个动物细胞）总RNA的提取纯化工作。
产品特点
RNA纯度高：配有基因组DNA吸附柱，可有效去除DNA污染
安 全：无需有机溶剂抽提
快速简便：操作过程30 min完成
使用方便：全流程室温操作，无需冰浴和低温离心
应用案例
MolPure® Cell/Tissue RNA Kit提取产量高，纯度高
取106个杂交瘤细胞，分别使用MolPure® Cell/Tissue RNA Kit和TRIzol（货号：10606ES）提取总RNA，50 μL RNase-free H2O洗脱。之后取1 μL洗脱液，测定浓度；取2 μL洗脱液，使用Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR SYBR Green Kit（货号：11143ES）进行定量测试小鼠GAPDH。结果显示，MolPure® Cell/Tissue RNA Kit能稳定提取RNA，RNA产量高，完整度较好。
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浓度（ng/μL） |
OD260/OD280 |
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Y1/Y2 |
733.01 / 851.95 |
1.84 / 1.97 |
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T1/T2 |
782.01 / 862.16 |
1.728 / 1.809 |
表1. Nanodrop测定RNA浓度
图1. 一步法反转录定量结果显示，Ct 值并无明显差异（注：绿色为 MolPure® Cell/Tissue RNA Kit，蓝色为 TRIzol）
柱式法核酸提取常见问题分析：
1. A260/280比值较低？或者A260/280比值较高？
用水作为洗脱液比较偏低，或者蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。
2.为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
3.冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取有区别吗？具体该怎么操作？
新鲜细胞与冻存细胞RNA提取没什么区别。千万不能等细胞溶解了存状态把Trizol直接加到冻存管了，一起化开，振荡振荡就可以了。与从组织中提RNA 差不多。
4.RNA得率低
组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。
5.RNA降解：
●提取的材料不新鲜。新鲜组织取得后应立即置于液氮中或立即放入RNAstore试剂中，以保证提取效果。
●处理样品量过大。
●污染了RNase。 虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase，但使用过程中很 容易污染RNase，应小心操作。
磁珠篇
磁珠法吸附原理：运用纳米技术，对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。在盐酸胍、异硫氰酸胍和外加磁场的作用下，能从血液样本中分离出DNA，并洗去非特异性吸附的杂质，得到纯化后的DNA，可应用于实验室检测。磁珠法提取的原理，具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，可以应用在血液、组织、拭子、鼻咽分泌物等样本之中。
磁珠法核酸提取流程：
磁珠法特点主要体现在：
1.能够实现自动化、大批量的实验操作。
2.操作简单，用时短，整个流程大约可以在30分钟内完成。
3.安全无毒，符合环保理念。
4.磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。
随着疫情的频发，翌圣生物迅速响应市场需求，推出了全自动核酸提取仪及配套试剂：
MolPure®磁珠法拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒
产品描述
MolPure®磁珠法拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒可用于从拭子、病毒培养上清液中分离纯化高质量的病毒DNA/RNA。通过采用独特分离作用的磁珠及精心优化的缓冲体系高效捕获释放的核酸，提取的核酸得率高、质量好，适用于各种下游应用实验，如RT-qPCR，qPCR 等实验。
产品特点
1. 提取效率高，重复性好，提取灵敏度高达100 copies/mL。
2. 样本适用性：适用于不同的样品类型，拭子、血浆等。
3. 仪器适配性：试剂形式多样化，适用于市售各种全自动核酸提取仪进行高通量提取。
4. 安全无毒：试剂不含酚、氯仿等有毒物质。
5. 自主研发，性价比高，货期快。
数据展示
●提取灵敏度高达100 copies/mL
图1：Yeasen MolPure®磁珠法拭子样本病毒DNA/RNA能够提取100 copies/mL口咽拭子新 冠假病毒，并且提取效率优于N*公司同类型产品。
● 重复性好（CV＜5%）
图2：Yeasen MolPure®磁珠法拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒重复性误差CV＜5%。
样本：200μL E5 copies/mL 新 冠假病毒。
产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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MolPure®Magnetic Swab Viral DNA/RNA Kit 磁珠法拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒（瓶装） |
18300ES60 |
100T |
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MolPure® Mag32 Swab Viral DNA/RNA Kit FA 磁珠法32孔拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒FA（预封装） |
18301ES32/59 |
2×16/6×16T |
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MolPure® Mag96 Swab Viral DNA/RNA Kit FR 磁珠法96孔拭子样本病毒DNA/RNA提取试剂盒FR（预封装） |
18520ES59 |
96T |
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MolPure® Magnetic Universal Viral DNA/RNA Kit 磁珠法通用病毒DNA/RNA提取试剂盒（预封板） |
18521ES59 |
96T |
2. MolPure®磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒
产品描述
MolPure®磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒适用于血液样本的基因组DNA的提取。采用独特的磁珠和精心优化的缓冲体系，可最大限度的分离纯化高纯度DNA。提取的基因组DNA纯度高，质量稳定可靠，适用于各种下游应用实验，如酶切，PCR，qPCR等。
产品特点
1. 提取得率高，纯度好，260/280在1.8-2.0之间。
2. 样本适用性：适用于新鲜血液、冻存血、血细胞等样本。
3. 仪器适配性：试剂形式多样化，适用于市售各种全自动核酸提取仪进行高通量提取。
4. 安全无毒：试剂不含酚、氯仿等有毒物质。
5. 自主研发，性价比高，货期快。
数据展示
● 适合各种保存条件下的血液样本
图3：Yeasen MolPure®磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒适合各种保存条件血液样本。
Line 1-2：为新鲜抗凝血液基因组DNA。
Line 3-4：为4℃保存7d的血液基因组DNA。
Line 5-6：为-20℃保存7d的血液基因组DNA。
Line 7-8：为-20℃保存30d的血液基因组DNA。
Line 9-10：为-20℃保存90d的血液基因组DNA。
客户反馈
● 人新鲜血液DNA提取（来源于：北京某客户）
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样本 |
核酸(ng/uL) |
A260/A280 |
A260/A230 |
|
1 |
129.50 |
1.95 |
2.08 |
|
2 |
176.12 |
1.93 |
2.26 |
|
3 |
91.87 |
1.95 |
2.04 |
|
4 |
101.14 |
1.94 |
2.14 |
|
5 |
164.69 |
1.91 |
2.05 |
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6 |
138.05 |
1.88 |
2.09 |
|
7 |
102.44 |
1.85 |
2.04 |
|
8 |
192.44 |
1.91 |
2.16 |
表1：Yeasen MolPure®磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒提取人新鲜血液样本。血液投入量为300 μL，洗脱体积70μL。使用32通道自动化核酸提取仪。结果：提取结果优于现有产品，满足客户的需求。
产品信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
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MolPure® Magnetic Blood DNA Kit 磁珠法血液DNA提取试剂盒（瓶装） |
18351ES60 |
100T |
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MolPure® Mag32 Blood DNA Kit FA 磁珠法32孔血液DNA提取试剂盒FA（预封装） |
18352ES32/59 |
2×16/6×16T |
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MolPure® Mag96 Blood DNA Kit FH 磁珠法96孔血液DNA提取试剂盒FH（预封装） |
18365ES59 |
96T |
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