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干货|你对DNase I“全能选手”了解多少？

脱氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I），是一种可以消化单链或双链DNA的非特异性核酸内切酶。它能够水解磷酸二酯键，产生含有5'-磷酸基团和3'-OH基团的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。DNase I最佳的工作pH范围是7-8，其活性依赖于Ca2+，并可被二价金属离子如Mn2+，Mg2+，Zn2+等激活。在Mg2+存在条件下，DNase I 随机剪切双链DNA的任意位点；Mn2+存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
 

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图1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理图
 
常见的DNase I主要从牛胰腺中纯化或为重组酶。与从牛胰腺中纯化的DNase I相比，重组酶来源的内源性RNase水平相对较低或者能够制备成无RNase产品形式，更适合对RNase敏感的应用，如从RNA样品中去除DNA。
 

DNase I 的应用

 
提到应用，DNase I除了大家熟知的用于维护RNA完整性相关实验，如提取不含DNA的RNA，反转录前制备无gDNA的RNA模板以及体外转录后降解DNA模板外，还可用于rRNA去除中消化DNA探针，缺口平移进行DNA标记，足迹法分析DNA-蛋白质相互作用，生成随机的DNA文库，减少细胞裂解物或蛋白提取物的粘性，在细胞培养过程中作为添加物来消化细胞间的粘连，在细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。综上所述，DNase I几乎可用于任何需要酶切DNA的应用中。下面小编简单介绍几种常见的应用。
 

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RNA提取或反转录前去除gDNA

 

RNA作为实验室常研究的样本，其质量的高低很大程度上会直接影响实验数据的质量。一般在RNA提取过程中无法完全避免gDNA残留，因此，在进行具有挑战性的下游应用（例如mRNA表达量分析，转录组分析等）之前，通常建议对RNA样本进行DNase I处理，消化残留的gDNA。消化gDNA步骤可以在RNA提取期间、RNA提取后或者RNA反转录之前进行。

图2：基于DNase I的gDNA去除流程

 

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体外转录去除模板DNA

 

体外转录（IVT）主要是以DNA为模板，在适当的底物和缓冲液的作用下，通过体外转录得到RNA。这一过程中，常用的RNA聚合酶包括T7，T3，SP6等，它们负责催化RNA的合成。然而，合成的RNA产品可能会含有DNA残留，消除DNA残留有利于下游实验的开展。

特别是在mRNA疫苗的研发过程中，去除这些DNA残留是一个非常关键的步骤，它直接关系到后续纯化过程的难易程度及最终产品的纯度。为了高效地消除模板DNA，通常采用DNase I进行处理，以确保RNA样品中不含有DNA残留，这一步骤有助于提高实验的整体准确性和效率。

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图3：线性化质粒为模板体外转录过程
 

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rRNA去除：常应用于RNA建库测序

 
在生物体内，rRNA丰度高且非常保守，其对于获取生物信息研究意义不大。然而，实验过程中提取到的总RNA中有95%是人源rRNA，这些rRNA的存在可能会干扰靶标RNA的检测。因此，在RNA建库测序中，通常会先将rRNA去除。目前，rRNA的去除方式以RNA酶消法为主，其主要操作步骤与原理如下：
 

操作步骤

 

1.提取Total RNA；

 

2.单链DNA探针和rRNA分子杂交结合（注：需要设计与合成rRNA 特异性单链 DNA 探针）；

 

3.RNase H降解杂交的rRNA；

 

4.DNase I降解DNA 探针；

 

5.rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。

 
 
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图4：基于酶法的rRNA去除原理示意图
 

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缺口平移法进行DNA标记

 
缺口平移法，是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。该方法是DNase I与E.coli DNA Polymerase I的联合作用实现的。
 

主要原理如下：

 

1.先用适宜浓度的DNase I在待标记的双链DNA的每一条链上产生若干个单链缺口，缺口处形成3’羟基末端。


2.再用E.coli DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性从缺口处5’端切除一个核苷酸，同时E.coli DNA Polymerase I的5’→3’聚合酶活性将一个带标记的核苷酸引入到缺口的3'端，以修补缺口，随着缺口在DNA链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的DNA链中。

 

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图5：缺口平移法进行DNA标记的原理示意图
 

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DNase I 足迹法分析实验

 
DNase I足迹法分析实验是一种精确鉴定DNA结合蛋白在DNA分子上的结合位点的检测方法。其原理是蛋白结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase I破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段（即“足迹”)，进而可以确定其序列。在凝胶图片中，相应与蛋白结合的部位没有条带。
 

实验大致步骤如下：

 

1.将待检双链DNA分子进行单链末端标记。


2.将蛋白质和DNA混合后，加入适量的DNase I进行酶切，形成不同长度的DNA片段。该过程需要控制酶的用量，最好保证相邻的DNA片段只相差一个核苷酸，并列设置未加蛋白质的对照。


3.从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA用PAGE电泳分离，放射自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。

 
常见应用：转录调控蛋白通过与启动子区域结合来调控靶标基因的转录。
 
相关实验：凝胶阻滞实验（EMSA）。EMSA可以确定蛋白是否与DNA直接结合，而DNase I足迹法分析实验则可以精确鉴定其结合的DNA序列。
 
 
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图6：DNase I足迹法分析实验原理图【1】
 
 

翌圣DNase I 选择指南

 
产品名称
产品定位
推荐应用
Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas 脱氧核糖核酸酶I，来源于牛胰腺（CAT#10607，10608）
未对RNase进行检测
主要应用于蛋白质研究: 从蛋白制备物中去除 DNA。
Recombinant DNase I (RNase-free)（CAT#10325）
无RNase残留，研究级别
适用于各种应用：从 RNA 和蛋白制备物中去除 DNA，如对RNase敏感的cDNA文库或用于RT-PCR实验样品制备。
UCF.ME® Deoxyribonuclease I  (DNase I) GMP-grade（CAT#10611）
无RNase残留，GMP药用级别。采用药用规格原辅料生产，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。
适用于各种应用：从 RNA 和蛋白制备物中去除 DNA，如对RNase敏感的cDNA文库或用于RT-PCR实验样品制备。
 
 

参考文献

  1. Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.
  2. Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparison of oncogenic HPV type‐specific viral DNA load and E6/E7 mRNA detection in cervical samples: results from a multicenter study[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.
  3. Huang Z, Fasco M J, Kaminsky L S. Optimization of Dnase I removal of contaminating DNA from RNA for use in quantitative RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.
  4. Kang D D, Li H, Dong Y. Advancements of in vitro transcribed mRNA (IVT mRNA) to enable translation into the clinics[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.
  5. Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Irreversible heat inactivation of DNase I without RNA degradation[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.
  6. Adolph S, Hameister H. In situ nick translation of metaphase chromosomes with biotin-labeled d-UTP[J]. Human genetics, 1985, 69: 117-121.
  7. Song C, Zhang S, Huang H. Choosing a suitable method for the identification of replication origins in microbial genomes. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.

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