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核酸提取总是出问题?别怕,答案在这

核酸作为一切分子生物学研究的基础,其提取通常是开启生物学研究的第一步,而且提取的核酸质量高低也是决定下游实验成败的关键因素之一。

 

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图片来源:pixabay

 

小翌总结一些现用核酸提取过程中的常见问题。

 

DNA提取:

 

1.A260/280比值较低?或者A260/280比值较高?
 

用水作为洗脱液比较偏低,或者蛋白质残留,但如果操作过程中使用了苯酚,则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留,没有使用RNaseA,或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。


2.提取的细菌基因组DNA有降解,为什么?
 

确认选用的培养菌体是否新鲜,如果菌体需要保存时,请于-80℃保存。

 

起始菌液量过多,导致菌液裂解不充分,部分DNA降解。

 

菌体本身富含DNA酶活性,加入Digestion solution后再加20uL0.5M EDTA溶液来抑制内源性核酸酶

 

 

3.提取的基因组DNA生物活性差,为什么?

 

 

提取的基因组DNA中盐分浓度过高,请严格按照说明书操作。

 

提取的基因组DNA中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。
 

4.碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时,看到的三条带分别是什么?

 

碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的,分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

 

5. 为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊醇?

 

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊为24:1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的氯仿与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。


 

RNA提取:

 

1.冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取有区别吗?具体该怎么操作?
 

新鲜细胞与冻存细胞RNA提取没什么区别。千万不能等细胞溶解了存状态把Trizol直接加到冻存管了,一起化开,振荡振荡就可以了。与从组织中提RNA 差不多。
 

2.RNA得率低
 

  • 该组织或者细胞中RNA含量偏低:不同细胞和组织中RNA的丰度不同,如肝脏,胰腺,心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg),脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg),膀胱,骨,脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。

     

  • 组织起始量太少或者太多:样品量过少,则细胞组织中RNA含量较低;样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力,裂解将不完全,从而导致RNA得率低。

 
3.RNA降解:
 
  • 提取的材料不新鲜。新鲜组织取得后应立即置于液氮中或立即放入RNAstore试剂中,以保证提取效果。

     

  • 处理样品量过大。

     

  • 污染了RNase。虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase,但使用过程中很容易污染RNase,应小心操作。

4.OD260/OD280比值偏低
 

  • 蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。

     

  • 苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。

     

  • 多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。

 

  • 设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

 

5.RNA 中有基因组DNA污染

 

  • 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚 / 氯仿抽。

     

  • 提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,降解 DNA。

     

  • 材料过量:增加试剂用量。

     

  • RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高。

     

  • 溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。

     

 

本次的分享就到这里,如果大家在核酸提取过程中遇到问题,欢迎到文章底部留言哦,专业的技术人员会解答您的疑问。

 

 

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