作为DNA分选磁珠的生产厂商,我们经常被客户问到的问题就是:高通量测序(NGS)文库制备时,DNA磁珠为什么可以用来纯化和分选文库?在这里我们整理相关的资料,对这个问题做简单的阐述。
分选磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含:磁珠、DNA、聚乙二醇(PEG)、以及盐离子等,在一定浓度的PEG和盐离子环境中,DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体),该过程是可逆的,在适当条件下,结合的DNA分子可以被洗脱回收。
纳米级别的磁珠表面性质不同,分离原理也不尽相同,但基本上固态的球状材料组成并无太大差异,基础结构一般分为3层,最内层的核心是聚苯乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁(Fe3O4),最外层表面是羧基(-COOH)修饰的高分子材料所构成,其中羧基行使与核酸结合的工作。
在整个体系中,PEG是影响DNA回收的决定性因素(其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、孵育时间等等)。DNA在一定浓度的PEG存在条件下,NaCl或MgCl2促进条件下,使DNA发生脱水反应,分子构象会发生急剧变化,由线状被压缩形成卷曲球状,继而聚集沉淀,同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中,特定分子量的PEG的功能主要是与盐离子共同作用,改变不同长度DNA的分子构象,同时增加体系的粘稠程度,使磁珠存在其中处于悬浮状态,不易沉降,增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥,从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果,除此之外,PEG与蛋白质具有相容性,也可去除样品中的蛋白质。
Fig[3]. critical PEG concentration versus NaCl concentration for different-size DNA fragments. DNA fragments: 307 bp (filled circles), 400 bp (open circles), 532 bp (filled triangles), and 604 bp (open triangles). Agarose gel electrophoresis: Lane 1, 68 mg/ ml PEG and 0.8 M NaCl; lane 2, 90 mg/ml PEG and 0.4 M NaCl; lane 3, 110 mg/ml PEG and 0.3 M NaCl; and lane 4, 110 mg/ml of PEG and 0.4 M NaCl.
当处于PEG和盐离子环境中的DNA,因脱水作用而发生分子构象改变后,会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团,与表面带负电荷的羧基磁珠结合,但如何解释负负电荷之间的作用,目前还不得而知。但普遍认为,这是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除其三者之间的离子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。
磁珠的出现,使得核酸制备的实验可以实现自动化,同时相较于传统的回收方式,还具有3个明显的优势:
1)效率更高,以DNA为例,1 mu/L磁珠的承载量可达7 mu/g;
2)避免使用有机溶剂,如酚类、氯仿等等,更加安全;
3)操作简单,无需离心,也更有利于保留核酸的完整性。
参考文献
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2. He, Z. Y., Xu, H., Xiong, M. & Gu, H. Size-selective DNA Separation: Recovery Spectra Help Determine The Sodium Chloride (NaCl) and Polyethylene Glycol (PEG) Concentrations Required. J. Biotechnol. 9(2014), 1241–1249.
3. He, Z., Zhu, Y. & Gu, H. A New Method for The Determination of Critical Polyethylene Glycol Concentration for Selective Precipitation of DNA Fragments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97(2013), 9175–9183.
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7. Lis JT. Fractionation of DNA fragments by polyethylene glycol induced precipitation. Meth Enzymol 65(1980):347–353.
磁珠经过不同功能基团的有效包被,可实现对核酸的高通量、自动化提取,已广泛应用于基因测序、分子诊断等领域。翌圣生物根据目前市场磁珠需求,集中专业科研人员,致力于磁珠系列产品的创新开发,目前已经拥有多款高品质核酸磁珠类产品,可应用于基因测序、PCR、克隆等多种实验!
名称 |
完美替代AMPure Hieff NGSTM DNA Selection Beads |
高效回收50bp以上DNA Hieff NGSTM Smarter DNA Clean Beads |
有效解决cfDNA大片段污染问题 Hieff NGSTM cfDNA Clean Beads |
适用 |
100bp以上DNA |
50bp-20kb DNA |
100-200bp DNA |
适用实验 |
DNA文库构建 PCR产物纯化 酶切产物纯化 |
PCR产物纯化 酶切产物纯化 |
cfDNA文库构建 cfDNA纯化 |
货号 |
产品名称 |
规格 |
12600ES |
1 mL/5mL/60mL/450mL |