qPCR是通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。对于染料法来说，建议Ct在15~30之间。在qPCR实验中，我们经常会遇到Ct偏大的情况，大致分为两种，一种是所有基因的Ct都偏大，另外一种是个别基因Ct偏大。针对以上问题，具体该如何解决呢？

 

 

所有基因Ct偏大

 

如果前期我们已做过预实验，对所有基因的Ct情况已有预判。正式实验时，若这些基因的Ct都偏大，那可能是模板质量的原因。可通过Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳实验评估RNA的质量，包括浓度、纯度及完整度。需特别注意的是，不建议通过测定cDNA浓度来评估模板质量，详见干货分享 | 你测定的cDNA浓度到底准不准？。

1、Nanodrop评估RNA浓度和纯度

纯度较高的RNA，OD260/280应在1.9~2.1之间，OD260/230应大于2。若不在正常范围内，建议重新提取RNA。您可以根据表1的参数来评估RNA的纯度。

表1. RNA纯度评估指南

OD260/280	RNA纯度
1.9~2.1	RNA纯度高
>2.1	可能降解，待验证
<1.9	蛋白残留
<2.0	含有盐离子或者一些含碳的有机大分子的残留
OD260/230	RNA纯度
> 2.0	无其它污染物
< 2.0	有碳水化合物，多肽，苯酚等污染物

2、琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整度

对于真核生物来说，RNA应该有三条带，分别是28S，18S及5S，28S与18S的条带亮度之比应是2：1，如下图。若条带弥散，表明RNA已降解，建议重新提取RNA。

图1. 真核生物完整的RNA琼脂糖凝胶电泳图

 

 

个别基因Ct偏大

 

 

除了上述情况以外，我们也会遇到大多数基因Ct正常，个别基因Ct >30的情况。这种情况可能是扩增效率低导致，也有可能是基因丰度低导致。

1、扩增效率低

建议做标准曲线评估引物的扩增效率，做标准曲线的具体操作见：《小翌实验手账》荧光定量PCR之引物扩增效率。

 

正常来说，扩增效率E应在90~110%之间，根据E = 10 ^-1/斜率 – 1公式计算，对应的斜率范围应在-3.1~-3.58之间。如果扩增效率不在正常范围内，建议重新设计2~3对引物，筛选出扩增效率最接近100%的引物。

2、基因丰度低

如果扩增效率在90~110%之间，Ct还是很大，那可能是基因的丰度低导致的。这里，给大家提供两种解决方案：

（1）选择与基因丰度相差较小的内参基因，可通过提高模板的投入量改善Ct值偏大的问题。

（2）建议选择高灵敏的产品。qPCR mix种类较多，检测灵敏度各有差异。高灵敏产品可在更宽的检测范围完成检出，利于低丰度基因的检出。

 

//////////

 

在此，给大家推荐一款高灵敏的SYBR Green产品，Hieff UNICON^® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat NO. 11184ES）, 该产品具有灵敏度高（可检测至单拷贝，如图2）、全平台通用等特点。

图2.Hieff UNICON^® Universal Blue 预混液可有效检测7个数量级范围的模板量，扩增效率高，可在宽广的线性范围内获得良好的线性关系。以2µl的10⁶-10⁰拷贝的质粒为模板，扩增人IL23R基因。

 

 

翌圣qPCR mix发表的文献（部分）

 

1. Wentao Dong et al. An SHR-SCR module specifies legume cortical cell fate to enable nodulation. Nature (2020).（IF 43）
2. Lu, XY., Shi, XJ., Hu, A. et al. Feeding induces cholesterol biosynthesis via the mTORC1–USP20–HMGCR axis. Nature (2020). （IF 43）

3. Han X., et al., Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq[J]. Cell. 2018 Feb 22;172(5):1091-1107.e17. （IF 30.410）

4. Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile temperature critically controls the differentiation and pathogenicity of T helper 17 cells[J]. Immunity, 2020, 52(2): 328-341. e5. （IF 21.522）

5. Xiao J, Li W, Zheng X, et al. Targeting 7-Dehydrocholesterol Reductase Integrates Cholesterol Metabolism and IRF3 Activation to Eliminate Infection[J]. Immunity, 2020, 52(1): 109-122. e6.（IF 21.522）

6. Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regulates blood cholesterol levels in humans and mice[J]. Cell Research, 2020, 30(4): 363-365.（IF 20.5）

 

产品信息

 

产品货号	产品名称	规格
11184ES08	Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix	5 mL

扫描下方二维码即可申请试用装，解决Ct值偏大的难题，体验高灵敏产品带给您的全新感受！

 

往期精品推荐

 

喜报 | 翌圣qPCR产品助力武大宋保亮团队荣登Nature杂志
化繁为简！小翌带你轻松搞定qPCR数据分析
干货分享 | qPCR常见问题及解决方案（建议收藏，文末有彩蛋哦）
干货分享 | 你测定的cDNA浓度到底准不准？
RNA降解对于qPCR实验的影响到底有多大？（附影响结果）

HB210225