核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是分离、鉴定和纯化核酸的主要方法。核酸电泳一般有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳因其分离范围较广，在实验室中应用更为广泛。既然应用的多，那么就可能会有各种各样的使用差异导致的问题。

 

下面小翌根据多年的售后经验，精心为您整理了核酸电泳的常见问题与解决方案。助您轻轻松松做实验，大把时间写文章~

1. 无条带

 

 

1) DNA条带跑出凝胶，减少电泳时间。

解决办法：电泳时，注意观察溴酚蓝跑到凝胶的2/3处即可停止电泳。缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

2) 染料的激发波长使用错误，选用适合的激发波长。

例如：核酸染料YeaRed（Cat NO.10202ES, Yeasen）最大激发波长是300 nm左右，需用紫外成像仪检测。YeaRed在可见光下激发（如蓝光成像仪）很弱，会导致没有条带或条带非常弱。

解决办法：改用紫外激发检测。

3) 凝胶中未加入染料或染料失效，更换新的染料，重新实验。

解决办法：换一支新的染料进行对比实验，确认是否为核酸染料导致。

2. 条带弱

 

 

1) 染料和核酸结合不充分导致大分子条带弱，增加染料浓度或减少核酸上样量。

可能原因：染料和核酸结合不充分导致大分子条带弱。小分子条带因核酸量小，很容易与核酸染料结合达到饱和状态，而大分子条带与核酸染料结合未饱和，从而导致条带弱些。

解决办法：适量增加胶中核酸染料浓度或适当减少核酸上样量，以保证核酸染料与核酸结合充分。

 

图1. 大分子条带弱

2) 染料迁移影响小分子条带弱，提高Marker上样量。

可能原因：染料迁移导致小分子条带弱。例如，在染料饱和的情况下，由于核酸染料EB带正电荷，核酸分子带负电荷，二者在电场中的迁移方向相反，而小分子DNA跑在最前面，相对结合的染料更少些，所以条带弱一些。

解决办法：属正常现象，无需优化。若想优化，可适当提高Marker上样量，选择大小合适的Marker，调整电泳时间；或者可改为泡染法，泡染法不会受染料迁移的影响。

 

图2. 小分子条带弱

3) 样品上样量不够，梯度提高样品上样量。

可能原因：样品或Marker上样量不够。

解决办法：根据说明书要求进行加样，或者根据实验调整加样量。

 

图3. 上样量不足导致条带弱

4) 样品部分降解，重新更换新样品实验。

a) 可能原因：核酸酶污染导致样本降解。

解决办法：不使用含有核酸酶的试剂和耗材，避免核酸酶污染。

b) 可能原因：泡染法染色时间过长。

解决办法：一般泡染法根据说明书推荐时间进行染色。

c) 可能原因：拍照前放置过久。

解决办法：电泳后及时观察、拍照。

d) 可能原因：Marker由于保存不当降解。

解决办法：按照说明书推荐的保存方式进行保存。

 

图4. Marker降解

3. 条带弥散

 

 

1) 琼脂糖溶解不充分、胶未完全凝固，需充分溶解琼脂糖，延长凝胶时间。

可能原因：琼脂糖溶解不充分，凝胶时间过短、胶未完全凝固，胶孔大小不均匀，导致核酸电泳速度不均匀，出现抹带现象。

解决办法：确认胶彻底溶解后溶液透明清亮，无油状。一般100 mL的1%琼脂糖凝胶的凝胶时间为30-40 min。

【注】溶胶过程需避免水分蒸发，可通过重新定容进行确认。

 

 

图5. 琼脂糖溶解不充分导致的条带弥散

2) 染料不均匀，配胶时需摇匀。

可能原因：核酸染料迁移的影响。因市面上的无毒核酸染料多为大分子结构，若不均匀，容易使得同样大小的DNA片段结合的核酸染料量不一样，迁移的速度就会受到影响，从而形成抹带。

解决办法：加入核酸染料后充分摇匀或者改用泡染法。

【注】若怀疑问题与核酸染料影响核酸迁移有关，可使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。如果染色后问题依旧存在，可判断问题与染料无关。可尝试优化其它条件。

 

图6. 核酸染料不均匀导致的条带弥散

3) 电压过小，增加电压至110-130V。

可能原因：电压过小，使DNA条带发生扩散。

解决办法：建议电压为5-10V/cm，一般是110-130V，最高不超过150V。

4) 缓冲溶液使用次数过多，建议一次性使用。

可能原因：离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳结果。

解决办法：经常更换电泳缓冲液。

5) 上样量过多，减少上样量。

可能原因：上样量过多会造成加样孔超载，导致拖尾或者弥散。

解决办法：一般情况下，5 mm宽的梳子可以加入0.5 µg的核酸，加样量根据加样孔的大小和核酸大小而定。因此根据琼脂糖胶孔大小适当的调整核酸的上样量。

6) 样品部分降解。

可能原因与解决办法参考“条带弱”中样品降解情况。

7) 琼脂糖凝胶浓度不合适，根据分子量大小选择合适胶浓度。

推荐参照琼脂糖凝胶浓度对照表1：

 

 

整体原则是大片段选择低浓度凝胶，用TAE缓冲电泳体系；小片段选择高浓度凝胶，用TBE缓冲电泳体系。

4. 条带弯曲或弧形

 

 

1) 电压过大，推荐＜150V，最好110-130V。

可能原因：电压过大，易导致条带弯曲拖尾现象。

解决办法：降低电泳电压，建议电压为5-10 V/cm，一般是110-130 V，最高不超过150 V。

2) 上样量过高，梯度降低样品上样量。

可能原因：核酸分子上样量过高，导致核酸与染料结合不充分，易导致条带弯曲现象。

解决办法：减少核酸上样量，对于未知浓度的样品，尝试1/2或1/3的常用上样量。对于Marker样本，稀释后效果更好。

以图7中的Marker为例，左图Marker上样量：原液5 µL，大分子条带弯曲、拖尾且分不开。右图：将Marker原液2 µL稀释5倍加10 µL，条带清晰不拖尾。

 

 

图7. 左：大分子条带弯曲拖尾分不开，右:条带分离清晰（Marker: 100 bp ladder）

3) 染料量不足，一般使用1×工作浓度。

可能原因：核酸染料量不足，导致核酸与染料结合不充分，易导致条带弯曲现象。

解决办法：一般根据说明书推荐的核酸染料1×终浓度进行实验，或适当提高核酸染料使用的终浓度。

 

图8. 左:弯曲拖尾分不开（YeaRed核酸染料终浓度0.25×），右:大分子条带分离清晰（YeaRed核酸染料终浓度：1×）

5. 样品条带与Marker之间指示大小不一致

 

 

1) 核酸染料不充足，一般使用1×工作浓度。

可能原因：核酸染料不充足，会发生迁移率误差情况。

解决办法：建议提高核酸染料的工作浓度.

2) 上样量差异影响，建议样品与Marker的上样体积相近。

可能原因：Marker与样本的上样量差异，会引起较大迁移误差。

解决办法：样品与Marker的上样体积相近，更容易跑出理想的电泳结果。

6. Marker缺带

 

 

1) 小分子条带跑出凝胶导致缺带，减少电泳时间。

解决办法：适当缩短电泳时间，降低电压，或增加凝胶浓度。

2) 相近的大分子条带分不开导致缺带，提升染料浓度或减少Marker上样量。

可能原因：Marker浓度比较高, 导致核酸与染料结合不充分。

解决办法：稀释后使用（参考图7）。具体情况，根据Marker说明书进行操作。

 

好了，小翌今天的分享到这里就结束了~

祝大家实验顺利！加油！科研人~

等等！

 

 

这里还有一个小秘密，一般核酸电泳以Marker为分子标记，如果以上内容不能够解决大家的核酸电泳问题，有可能是你的核酸染料与Marker不兼容呢！可以尝试更换相应产品，判断、解决问题~

 

小翌这里推荐大家购买Yeasen安全无毒核酸染料（Cat NO.10202ES）与相应的Marker搭配使用更香哦！

 

 

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产品名称	产品货号	规格
YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)	10202ES76	500 μL
2000 DNA Marker	10501ES60/80	100/1000 T
5000 DNA Marker	10504ES60/80	100 /10×100 T
100 bp DNA ladder	10507ES60/80	100 /10×100 T
1 kb DNA ladder	10510ES60/80	100 /10×100 T
Agarose琼脂糖	10208ES60/76	100/500 g

HB201127