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酶切法vs机械法PCR-free建库试剂盒(1h/1ng极速建库)

高通量测序中，常规的文库构建需要PCR扩增，一方面，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，另一方面，可以放大荧光信号，让测序仪更容易捕获和识别荧光信号，提高测序准确度。但是，PCR就像一把“双刃剑”，在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时，却也引入了扩增错误和偏向性，不能完美地呈现基因组序列“真实面貌”。因此，PCR-Free技术的引入，既具备了PCR的优势，也克服了PCR的缺点。

1609807548463768.png

图1. PCR-Free技术优势
 
 
酶切法PCR-free建库试验验证
 
实验目的：
验证酶切法PCR-free建库试剂盒最低样本投入量。
实验描述：
不同来源样本，不同投入量，统一酶切12min不分选，进行PCR-free建库，使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。
结果展示：

建库信息

12209试剂盒（片段化/末修/加A+接头连接）

模板

NA12878

小牛胸腺

E.coli

编号

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

A11

A12

A13

A14

A15

投入量-ng

1

5

10

50

145

1

5

10

50

180

1

5

10

50

186

回溶体积-μl

5

10

10

21

21

5

10

10

21

21

5

10

10

21

21

Qubit-ng/μl

0.25

0.6

1.23

3.02

8.72

0.29

0.5

1.31

3.5

11

0.22

0.55

1.43

3.46

11.4

产量-ng

1.25

6

12.3

63.42

183.12

1.45

5

13.1

73.5

231

1.1

5.5

14.3

72.66

239.4
注：由于部分接头残留，Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。
1609807726770802.png
注：由于Y接头结构的影响，2100不能准确分析PCR-free真实文库大小；电泳图-文库主带约在380-400bp。
图2. A5、A10、A15 PCR-free文库电泳图及A3、A8、A13 2100峰图
结论：
酶切法PCR-free建库试剂盒，样本最低投入可低至1ng。
 
 
机械法PCR-free建库试验验证
 
实验目的：
对照试验，实验条件与上述酶切建库一致，验证低投入量机械法建库产量与酶切法差别。
实验描述：
不同来源的样本，统一机械打断，用相同的比例分选出300bp大小的插入片段，选择投入1/5/10 ng分选产物进行PCR-free建库，使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。
结果展示：

建库信息

12201（末修/加A+接头连接）

模板

NA12878

小牛胸腺

E.coli

编号

B1

B2

B3

B4

B5

B6

B7

B8

B9

投入量-ng

1

5

10

1

5

10

1

5

10

回溶体积-μl

5

10

10

5

10

10

5

10

10

Qubit-ng/μl

0.256

0.59

1.2

0.28

0.53

1.01

0.24

0.52

1.13

产量-ng

1.28

5.9

12

1.4

5.3

10.1

1.2

5.2

11.3
注：由于部分接头残留，Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。

1609807792148610.png

注：超声分选模板-主带大小300bp，即PCR-free文库大小约420bp
图3. 超声分选模板2100峰图（左）及B3、B6、B9文库2100峰图（右）
结论：
机械法PCR-free建库试剂盒，1/5/10 ng投入文库产出与酶切法相近。
 
 
总  结
 
根据Qubit值判断，酶切法PCR-free建库高低投入量均有文库产出，且低投入量文库产出与机械法PCR-free建库相当。文库2100峰图显示PCR-free文库有微量接头残留，实验时接头用量需根据实际情况进行调整。（注：实际样本操作时，建议选用qPCR文库定量，可更直观显示有效文库产量）
由上述两个实验可以看出，酶切法PCR-free建库低投入量实验完全可以达到机械法建库的效果，而且建库流程精简，无需复杂的机械片段化过程，一步完成片段化/末端修复/加A ，1h即可完成整体的建库流程，是目前快速建库的不二之选。
 
 
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Hieff NGS® OnePot PCR-free DNA Library Prep Kit
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产品特点：
1）适用样本类型广：适用1ng-1μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
2）无偏好性：高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段无偏好性
3）超高品质酶学组成：文库转化率，最高可达80%以上
4）品质稳定：严格的批次性能与稳定性质控
 
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产品类型

名称

货号

建库试剂盒

Hieff NGS® OnePot PCR-free DNA Library Prep Kit

12209ES08/24/96

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12615/6/7/8ES04/16

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Hieff NGS® DNA Selection Beads

12601ES03/08/56/75

文库定量

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12640ES60/76

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

12302ES05/09

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6

12307ES09

400-6111-883