外泌体研究历程，你知多少？
外泌体（Exosome）参与细胞之间的交流，物质的运输以及正常生理过程的维持、还与许多疾病息息相关，目前越来越多的人做这方面的研究。关于外泌体提取、组成、“载体”和相应功能的精准分子机制近些年越来越受到关注，而且发表的有关外泌体的文章也在逐年增加。外泌体（Exosome）的研究历程主要包括外泌体提取与纯化、外泌体鉴定与检测、外泌体荧光标记、和外泌体的蛋白组学以及下游机制研究等。下面我们就简单介绍一下外泌体的研究历程。
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什么是外泌体？
外泌体（Exosome）是一种由活细胞分泌到细胞外环境的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要载体。外泌体天然存在于体液中，参与细胞间相互作用。
• 大小：直径约30~140 nm，比微泡小；
• 密度：密度约为1.13~1.19g/ml；
• 结构：双层膜囊泡状结构小体；
• 数量：人体中大约有1014个，平均每个细胞产生1000~10000个；
• 细胞源：人体中几乎所有类型的活细胞均能产生外泌体；
• 异质性：同一种细胞分泌的外泌体，也会存在功能区别；
• 分布：外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等体液中；
• 外泌体产生于细胞中的多泡体。
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外泌体组成与功能
外泌体（Exosome）携带大量特异性的蛋白质以及功能性的mRNAs、miRNAs等，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。不仅可以作为诊断多种疾病的生物指标，也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗，是液态活检领域“三驾马车”之一。以下为外泌体的提取、纯化、鉴定和分析过程。
图1. 外泌体组分
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外泌体分离
目前已经开发出多种外泌体（Exosome）提取方法包括：密度梯度，体积排阻，免疫磁珠和基于聚合物沉淀的方法。根据外泌体的体积，密度和表面标志物的不同进行分离，不同提取外泌体方法优劣势比较如下：
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分离方法 |
分离原理 |
优点 |
缺点 |
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超速离心法 |
根据颗粒的密度，大小，形态逐级离心 |
成本低；容量大； 试剂污染小。 |
仪器价格比较高； 操作时间比较长； 外泌体形态受损。 |
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超滤法 |
超滤膜用于从蛋白质和其它大分子分离外泌体。外泌体群集中在膜上。 |
速度快； 不需要特殊仪器； 使用轻便。 |
压力会破坏外泌体； 吸附造成损失；堵塞滤膜。 |
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体积排阻法 |
体积排阻层析分离基于它们的大小。它使用填充有多孔聚合珠的柱子。 |
纯度高；外泌体形态和活性较好； 重复性强； 上样量大 |
需要精密的仪器； 花费较大； 时间比较长。 |
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外泌体沉降法 |
利用外泌体的溶解度或者分散性通过排水聚合物进行沉淀 |
使用方便；不需要特殊仪器； 可以大量制备。
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非外泌体物质会发生共沉淀。 例如蛋白质，RNA，聚合物原料，需要进行样品的前处理和后处理。 |
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免疫磁珠法 |
通过外泌体表面蛋白的抗原抗体相互作用 |
特异性强； 纯度较高。
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试剂价格昂贵； 适用性比较低； 产量较低； 只针对没有细胞的样品。 |
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色谱法 |
根据外泌体的大小进行分离 |
得到的外泌体大小均一 |
设备特殊，价格高，应用不广泛 |
目前翌圣生物公司提供的细胞上清/血清血浆外泌体提取试剂盒（货号：41201ES25和41202ES），采用独特的分离技术，可以快速从细胞培养上清中获得大量完整的外泌体颗粒，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、Western Blot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。细胞上清外泌体抽提试剂实验流程如下：
图2. 细胞上清外泌体抽提试剂盒实验流程
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外泌体鉴定
外泌体的功能研究第一步，即进行外泌体的鉴定。目前包括电镜法、NTA粒径法、WB法、核酸分析法等来鉴定外泌体的结构、特异性蛋白、核酸序列等。
在外泌体研究中，电镜能够直接观察到样品中外泌体的形态。并且具有很高的分辨率，能够鉴别大小不一的外泌体。但对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量。而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量。
图3. 电镜分析外泌体形态结构（图片来源：Current protocols in cellbiology(2006): 3-22）
NTA技术是表征外泌体的浓度粒径测试手段之一，对不同大小的外泌体颗粒追踪和分析，可计算出外泌体的直径和浓度。相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。
图4. NTA分析外泌体颗粒直径符合标准， 颗粒分散性好，大小均一。
WB分析典型的标记蛋白包括四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81等，定性鉴定检测需要选择至少2个指标才能达到文章发表要求，比如检测CD63和TSG101。外泌体鉴定试剂盒（货号：41203ES05 ）是翌圣生物针对外泌体标志蛋白CD63和TSG101检测而研发的一款高效且方便的产品。试剂盒内的抗体经过严格筛选而得，适用于外泌体CD63和TSG101蛋白的检测。
该产品适用于人、大鼠、小鼠外泌体的鉴定。
图5. P为CD63&TSG101阳性对照品；S为外泌体样品
外泌体中含有大量的RNA和DNA，包括功能性的 mRNAs、miRNAs、lncRNA、mtDNA等，这些RNA分子以外泌体为载体进入靶细胞后，会通过不同的机制对靶细胞产生影响。可通过实时荧光定量PCR法、高通量测序技术分析外泌体RNA分子差异，是对外泌体RNA功能研究的有效手段。
图6. qPCR法分析细胞上清液提取出的外泌体
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外泌体荧光标记
通过对外泌体体外荧光标记示踪，可以对外泌体功能性进行研究，包括蛋白组学研究、外泌体活体成像实验、外泌体启动子活性研究等。目前荧光标记外泌体的方法有很多，主要包括亲脂性染料PKH-67/PKH-26、亲脂性羰花青染料DiI/DiD/DiO/DiR、以及渗透型的化合物标记法：CFSE/CFDA/Calcein-AM等。
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外泌体相关FAQ
1. 不同样本提取外泌体参考体积？
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样本体积（参考量） |
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样本类型 |
电镜、NTA粒径、Western Blot |
多基因核酸分析（qPCR）、NGS测序 |
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细胞上清* |
10-20 mL |
40-60 mL |
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血清 |
1 mL |
2 mL |
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血浆 |
1 mL |
2 mL |
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尿液 |
20 mL |
50-60 mL |
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脑脊液 |
10 mL |
20-30mL |
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精液 |
1-2 mL |
2-5 mL |
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唾液 |
5-10 mL |
10-20 mL |
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腹水 |
10-20 mL |
20-40 mL |
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羊水 |
10-20 mL |
20-40 mL |
|
乳液 |
5 mL |
10-20 mL |
2. 外泌体血液样本提取需注意事项？
全血经过长时间放置，冷冻、离心、会发生溶血现象，无法提取外泌体，必须做好血清血浆的分离。以及去除血清外源的外泌体。
3.如何去除血清外源的外泌体。
a.将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h，去除血清外泌体；
b.选择无血清培养基进行细胞培养。
4.细胞上清外泌体提取试剂盒（货号：41202）可以提取哪些样本的外泌体？
细胞上清液、尿液（可直接提取）、脑脊液（需处理后再提取）。其他的组织液包括体液、唾液、卵泡液、精液等提取效率较低，建议客户用专门的组织液提取试剂盒。
5.如何提取组织细胞外泌体？
无菌环境下将组织剪成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养12h；将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中；先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再按照本试剂盒说明书提取外泌体。
6.外泌体如何保存？
纯化后的外泌体可于 4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存，避免反复冻融。
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外泌体相关产品推荐
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名称 |
货号 |
规格 |
价格（元） |
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外泌体提取 |
Hieff Quick exosome isolation kit（for Cell Culture Media）
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41201ES25/50 |
25 mL/50 mL |
2155.00/ 3855.00 |
|
Hieff Quick exosome isolation kit（ for Serum/Plasma）
|
41202ES30 |
30 mL |
2155.00 |
|
|
外泌体定量 |
|
20101ES60 |
100 mL |
228.00 |
|
BCA Protein Quantification Kit BCA
|
20201ES76 |
500T(100 mL) |
228.00
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外泌体鉴定 （Western Blot） |
Precast Protein Improve Gels, 4%-20%, 10 wells
|
36231ES10 |
1盒（10块） |
573.00 |
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GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker（10-180 kDa）
|
20351ES76 |
2×250 μL |
585.00 |
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31293ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1285.00/2285.00 |
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30039ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1285.00/1985.00 |
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31514ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1385.00/2385.00 |
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30009ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1285.00/1985.00 |
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31513ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1385.00/2385.00 |
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31428ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1385.00/2385.00 |
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30011ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1285.00/1985.00 |
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30010ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1285.00/1985.00 |
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|
31512ES50/60 |
50 μL/100 μL |
1385.00/2385.00 |
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外泌体标记 |
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40725ES10/25 |
10/25 mg |
488.00/988.00 |
|
DiR Iodide (DiIC18(7)) 细胞膜深红色荧光探针
|
40757ES25 |
25 mg |
988.00 |
HB20200927
