蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本的总蛋白中分离出来，同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。在构建载体阶段，除了一些必要的表达元件，还需要考虑的密码子优化以及标签的选择。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。以下简单列举几个常见蛋白标签：

表1. 不同蛋白纯化标签介绍

His-Tag 为何会逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。其主要优势在于：

高序列兼容性：N-端的His-tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；

小序列影响小：His-tag非常小，His-tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；

免疫原性低：His-tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；

联合使用性强：与其他的亲和标签构建成亲和标签，并可用于多种表达系统，纯化的条件温和；

适用范围广：his标签融合蛋白的适用范围也较广，即可用在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。

因此，His逐渐成为了蛋白纯化的首选标签。

Yeasen生物自主研发的HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni²⁺）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

 

图1. His树脂的产品原理图

图2. His树脂的产品特性

1）装柱：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化重力柱中；

2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗重力柱；

3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡含有填料的重力柱；

4）上样：注意控制加样速度，耐压0.1 MPa，流速控制在10滴/min，确保目的蛋白与Ni²⁺充分接触，以提高纯化得率；

5）洗杂，低浓度咪唑的缓冲液进行洗杂；

6）洗脱：使用5-10倍柱料体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。

图3. His蛋白纯化简易流程图

测试产品：

1、某知名品牌his纯化产品；

2、大量生产的FF高流速产品；

3、小样生产的FF高流速产品；

4、本次生产的普通级别的his树脂（20502ES）；

缓冲液：各个处理组均为1ml树脂纯化200 ml菌液；洗杂使用25mM的咪唑，洗脱液为250mM的咪唑。

测试报告一：His纯化树脂结合效率测试，与市场知名品牌进行对比，Yeasen研发的20502ES  HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4号）具有良好的结合效率。如下图：

图4. His纯化树脂结合效率测试

测试报告二：以常利用的变性剂尿素为例，分别进行了不同产品在8M尿素下耐受性测试， 20502ESHisSep Ni-NTA Agarose Resin （4号）对尿素的耐受良好，与市场知名品牌无差异。如下图：

图5. His树脂对8M尿素耐受性测试

测试报告三：对于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin（4号）进行了批次检测稳定性测试，从结果看批次间差异基本控制在5%以内，以保证更好的稳定性。如下图：

图6. His纯化树脂的批次间比较