1、DNA文库构建方法的选择：为什么酶切法建库如此备受青睐？

酶切法构建DNA文库，相较于传统的超声法和转座酶法具有以下优势：

无偏好片段化酶：具有稳定的片段化效果，无需复杂的机械片段化过程。酶切产物片段大小同样本类型、Input DNA量和GC含量等均无相关性，仅与酶切时间有关。

DNA损伤风险低：机械力会引起DNA的物理损伤，尤其是对于脆弱或较少量的样本。酶切法使用的片段化酶是针对特定序列进行切割的，这种生物化学反应通常在较温和的条件下进行，能够最大限度地减少对DNA的物理损伤。

建库流程精简：一步完成片段化/末端修复/加A ，片段化/末端修复/加A （30min）-接头连接（15min）-纯化/分选（30min）-文库扩增（15min）-纯化分选（30min），常规建库预计耗时约2h，PCR-free建库预计耗时1h。

宽泛的样本投入范围：相比较固定投入量，固定酶切时间的TN5建库，酶切法建库适用500 pg-1 μg，满足个性化建库。

翌圣Onepot系列酶切法建库流程

2、酶切法建库运用的是什么酶，类似限制性酶切酶吗，具体如何打断DNA呢？

不同于限制性酶切酶，片段化酶是随机内切酶，不受特定酶切位点的限制，随机切割对应模板DNA，片段化的产物属于粘性末端，后续需要进行末端修复。

3、酶切法建库适合哪些应用研究，对样本具有普适性吗？

酶切法建库可适用全基因组测序（含PCR-free文库构建）、全基因组重测序、全外显子或其他靶向捕获测序、宏基因组测序等。适合样本类型包含gDNA、cDNA和FFPE样本等，不适合cfDNA（cfDNA无需打断）。

4、酶切法建库试剂盒针对哪些样本建库效果比较好？

兼容范围为1 ng – 1μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。基因组DNA和cDNA均可获得高产高质的文库。

举例：展示为翌圣onepot pro系列12972ES应用于不同物种的文库均一性测试

结论：以200 ng不同物种gDNA为模板，使用12972ES和厂商A建库试剂进行文库构建，胶图显示，12972ES在文库均一性上表现优于厂商A。

5、对于不同类型的DNA样本，酶切时间如何控制？

对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间如下：

为保证优质精确的片段化效果，建议在自身实验体系中进行微调。

6、gDNA片段化参考说明书酶切条件酶切20 min，竟然切不动？

一般优先考虑DNA的质量问题，比如 Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐离子，可能会影响酶切效果，建议将DNA稀释在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再进行片段化。其次，如果样本是反转录得到的全长cDNA，则需考虑样本纯度问题。另外，对于环状DNA的酶切，需要另行摸索酶切时间体系。特殊样本可考虑磁珠纯化之后进行酶切或适当延长酶切时间。

7、FFPE样本，酶切时间太难控制了？

众所周知，FFPE样本虽然使组织得以长期保存，但其特殊的制作方法和保存过程对核酸分子造成多方面的影响：核酸与蛋白交联、降解严重等诸多问题。我们先来看下不同质量的FFPE样本，采用相同的酶切条件影响有多大。

举例：相同酶切条件下，质量高的样本酶切效果较好，满足需求（样本4），质量差的样本出现过度酶切现象，酶切片段偏小（样本1/3）。

因此对于不同降解程度的FFPE样本，建议做好质量控制，对样本进行分层级，不同层级的推荐酶切时间参考下表。

备注：FFPE样本DNA质量也可通过琼脂糖凝胶电泳胶图简单判断，高质量样本-DNA质量大于10kb，条带明亮单一，建议酶切10 min左右；一般质量样本-胶图显示无明显主带，整体弥散条带，建议酶切6-8 min；质量较差样本-胶图无主带，整体条带弱，建议酶切2 min；极差FFPE样本，建议可不酶切，搭配FFPE修复试剂直接建库。

8、DNA酶切后文库出现大片段残留？

酶切文库出现大片段残留现象，考虑Input DNA纯度外，建议适当延长酶切时间或提高酶切温度。另外，也需要选择合适的循环数，循环数过高会导致过度扩增，过度扩增文库会出现大片段残留。

9、酶切时间也不长，竟然过度酶切了?

以插入片段300 bp为例，白细胞gDNA，30 ℃酶切20 min，出现如下图过度酶切现象。建议参考酶切条件需要考虑不同样本gDNA大小，如白细胞gDNA较小，应适当缩短酶切时间，否则易出现如下过度酶切现象。

10、酶切法建库，如何做到较好的质量控制？

1）文库浓度检测：qubit法或qPCR

2）文库长度检测：琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100/2200或Qseq

3）文库质量鉴定：Agilent 2100/2200或Qseq

4）文库大小分布、引物二聚体和过扩增产物的缺失，可通过电泳方法进行确认

构建优质的DNA文库不仅需关注上述因素，还需选择高质量的建库产品。翌圣生物为满足广大科研工作者的NGS建库实验需求，推出了全面的NGS建库解决方案，方便大家根据具体实验需求进行选择。