“同源重组技术” 一步法快速克隆技术常见问题集
过去
提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词，大家可能先想到的是传统“酶切酶连法”，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过碱基互补配对，T4 DNA Ligase连接两个片段的克隆方法。
近年
“同源重组技术”逐渐受到科研人员的欢迎，如翌圣Hieff Clone®一步法快速克隆技术。相比之下，同源重组技术操作更加简单，不受到酶切位点的限制，可一次进行多个片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
虽然同源重组技术操作简单，但毕竟实验过程是环环相扣的，一旦某个细节处理不好，都可能导致实验失败。为此，小编精心整理了同源重组实验的常见问题，并给出了可能的原因和解决方案。希望新手们在遇到类似问题时可快速判断可能的原因，节省时间，更顺利的完成实验。
常见问题分类：
无克隆、假阳性、菌落PCR无条带、酶切鉴定多条带
出现无克隆的现象，可能的原因主要是连接不成功或连接成功，但转化失败。具体原因分别如下：
1、 连接不成功
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可能原因 |
解决方法 |
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1）引物设计错误。 |
1）设计原则：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。 2）判断方法：可用翌圣无缝克隆引物设计软件核对 |
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2）载体与目的片段使用比例失调。 |
1）载体和目的片段浓度测定方法：常用吸光度法或琼脂糖电泳法。 2）载体与目的片段添加比例： ①单片段建议：最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3，载体使用量为0.03 pmol；目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。 ②多片段建议：最适DNA使用量为每片段（含线性化载体）0.03 pmol。 |
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3）载体与目的片段不纯。 |
1）推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。 2）纯化产物建议溶解在pH8.0的ddH2O中保存。 3）若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积1/5。 |
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4）操作问题或试剂盒失效。 |
建议做试剂盒附带的阳性对照实验。判断方法： 1）若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。 2）若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效，建议换其他人或换试剂盒进行阳性对照实验，进一步确定问题。 |
2、 连接成功，但无克隆
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可能原因 |
解决方法 |
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1）感受态细胞效率低，如＜ 107 cfu/μg。 |
建议用转化效率＞107 cfu/μg的感受态细胞。 判断方法：可转化0.1ng质粒（如PUC19），观察克隆数，若生长大于1000个菌斑，则转化效率大于107cfu/μg。 |
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2）抗生素种类错误。 |
建议将未线性化载体转化涂板。 判断方法：若未长克隆，则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。 |
出现假阳性的情况，主要表现有两种，克隆不含插入片段或含有错误的插入片段。具体原因分别如下：
1、克隆不含插入片段（空载）
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可能原因 |
解决方法 |
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1）载体线性化不完全。 |
建议将已制备的线性化的载体转化涂板。 判断方法：如果长克隆较多，则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。 |
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2）体系中混入了相同抗性的环状质粒。 |
1）产生原因： ①以反向PCR方式进行载体线性化，残留环状质粒模板导致。 ②目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒，残留环状 质粒模板导致。 2）判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用DpnI 消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。 |
2、克隆含有错误的插入片段
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可能原因 |
解决方法 |
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1）PCR产物混有非特异扩增产物。 |
1）可能情况：PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。 2）解决方案： ①优化PCR体系，提高特异性； ②胶回收PCR产物； ③鉴定更多的克隆。 |
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2）片段缺失。 |
1）可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。 2）解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI， Vector NTI等）。 |
出现菌落PCR无条带的现象，可能与PCR扩增或重组连接有关，具体原因分别如下：
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可能原因 |
解决方法 |
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1）菌落PCR引物错误。 |
建议用载体的通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。 |
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2）PCR体系或程序不合适。 |
1）可能情况：用目的片段引物和载体通用引物扩增都无产物。 2）解决方案： ①优化PCR体系、程序； ②提取质粒，以质粒做模板PCR验证； ③换酶切法鉴定克隆。 |
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3）连接失败。 |
1）判断方法：目的引物或一端载体通用引物，另一端目的引物扩增无条带，但载体通用引物扩增有条带，且大小符合空载。2）可能原因：载体线性化不完全。建议优化酶切体系。 |
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可能原因 |
解决方法 |
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重组载体上有多个相同的酶切位点。 |
1）换其他酶切位点进行酶切鉴定。 2）更换克隆鉴定方法，如换成菌落PCR或测序鉴定。 |
以上就是翌圣生物为大家整理的同源重组的常见问题及相应的建议，希望对大家有所帮助。如果还有其它更多关于同源重组的问题，欢迎留言或来电。如果您之前在用传统酶的切酶连技术，现对高效的同源重组技术跃跃欲试，那赶快行动起来吧！
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产品定位
Hieff CloneTM一步法克隆
产品优势
● 无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
● 设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
● 快速：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
● 应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
客户反馈数据
高效、快速单片段连接
注. A: 阴性对照转化平板; B: 重组质粒转化平板; C: 1和2分别为原始载体和线性化载体浓度检测电泳图; D: 目的片段的浓度检测电泳图; E: 目的片段的菌落PCR鉴定电泳图; F: 1为重组质粒的酶切鉴定电泳图, 2为原始质粒酶切对照图; M: DL10000。pCAMBIA1300载体: 10217bp, 目的片段: 2352bp。
高效、快速多片段连接
注. A: 重组质粒转化平板; B: 1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图; C: 菌落PCR验证结果, 其中1为原始质粒对照电泳, 2-5为重组质粒, 仅检测867bp的一个目的片段, 6为假阳性; D: 阳性克隆测序结果; M：Marker II。pBR322载体：3996bp，目的片段：576bp+867bp+915bp+647bp。
发表部分文献
[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.（IF 36.616）
[2]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol.2018 Oct;20(10):1145-1158.（IF 20.06）
[3]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）
Hieff CloneTM TOPO克隆
产品优势
平末端和A末端PCR产物均可在瞬间（几秒钟-5分钟）完成连接；
无需并与和热休克，室温5分钟内完成转化；37℃ 10分钟复苏可以涂板；
客户反馈数据
发表部分文献
[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.（IF 37.205）
[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（IF 30.41）
[3] Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)
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