干货分享|磁珠常见问题与解决方案
高通量测序技术的跨越式发展，使测序能力大幅上升。在整个NGS工作流程中，磁珠是必不可少的产品。
磁珠通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理，将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作，广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。
看起来很简单的纯化/分选实验，却在实际实验中有各种意外的情况。那关于磁珠产品选择和产品使用方面有什么需要注意的事项呢？接下来小翌将从磁珠的外观、储存、应用和使用效果逐一对症分析，希望能帮助大家了解磁珠实验中的那些事。
Q：如何从磁珠的外观区分磁珠是否正常？
A：正常磁珠静置时，微珠与buffer分层，聚集在瓶身底部，使用前震荡混匀，微珠均匀分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巯基乙醇、DTT、pH差值大等因素，影响磁珠的均一性，使得磁珠粘稠，聚集成块或出现挂壁的现象。
图1. 正常磁珠外观图
图2. 非正常磁珠外观图
Q： 不小心将磁珠放到-20℃，但未结冰，是否可以继续使用？
A：不建议使用。因为低温会破坏磁珠的结构，使得磁珠的抓取效率降低，影响磁珠回收性能。
Q：磁珠未开封的时候4℃保存，开封后一直室温保存使用，是否会影响磁珠的回收性能？
A：室温放置对磁珠的回收性能会有一定影响，不建议室温放置太久，使用完后建议4℃保存。PEG分离效果易受pH、温度等影响。
Q：磁珠分选的原理是什么？
A：第一轮磁珠结合分子量较大的DNA，通过丢弃磁珠去除这部分产物；第二轮磁珠结合剩余产物中分子量较大的DNA，通过丢弃上清去除分子量较小的DNA。
初始样品中的很多组分都会干扰双轮磁珠分选效果。因此，当分选方案执行位置不同时，双轮磁珠使用量也不尽相同。
Q：产品的主要应用是什么？
A：产品主要应用于高通量测序DNA片段的纯化和分选。对于PCR或者酶切DNA产物的纯化也可以使用。可以有效去除dNTP，引物，引物二聚体，接头，接头二聚体，盐离子等杂质。
Q：产品可以重复使用吗？
A：产品不可以重复使用，乙醇洗脱步骤将影响磁珠表面活性基团性能。
Q：与AMPure XP相比，怎么样？
A：我们的产品制备原材料完全进口，可以完美替代AMPure XP Beads。在使用方法，文库大小分布和回收效率上，与AMPure XP Beads完全一致，您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用，无需摸索条件。
Q： 磁珠可以吸附ssDNA吗？
A：可以回收单链DNA，具体性能没有测试过。附图是Beckman磁珠回收单链DNA的数据，可以作为参考。
图3. XP磁珠回收单链DNA效果图
Q： 分选磁珠可以纯化gDNA吗？
A：翌圣分选磁珠测试过最大20kb的片段，回收率>90%。基因组 DNA 未测试过，测试时，由于大DNA与磁珠结合的非常紧，建议尽量增加洗脱液体积，避免干燥时间过久。
Q: 分选磁珠是否可以进行片段产物纯化？
A: 根据客户反馈结果，分选磁珠可以进行片段产物的纯化。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的产物，通过去除上清即可对 200 bp 以下的片段进行去除；1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的产物，通过去除上清即可对 150 bp 以下的片段进行去除。
Q：磁珠的DNA结合能力怎么样？
A：在目前的磁珠体系中，磁珠的吸附能力均为过饱和，客户不必担心磁珠结合能力不足的情况。根据已知的报道，每1 μL磁珠可以结合7 μg DNA。
Q： 使用磁珠吸附小片段的时候，大片段也会吸附上来吗？
A: 磁珠优先吸附大片段，增大磁珠投入量时，磁珠会在吸附大片段的基础上增强吸附小片段的能力。
举例说明：参考磁珠纯化分选表，100 μL样本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此时磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，当磁珠投入量至100 μL时，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。
Q：分选磁珠是否可以用于提取DNA？
A：使用分选磁珠可以实现直接将样本裂解后用磁珠将其中的gDNA提取出来，可能效率没有专用试剂盒的高，因为我们这款磁珠的定位是在纯化和分选。
Q：使用磁珠分选/纯化之后，还有小片段残留是怎么回事？
图4. 二聚体残留效果图
A：小片段残留大部分是接头二聚体（127bp）/引物二聚体（80bp）。若纯化，降低磁珠比例；若分选：可适当降低二轮磁珠比例可有效改善此类情况。
Q：磁珠回收率低可能的原因是什么？
A：1）磁珠与DNA混匀不充分，未能充分吸附。建议反应体系充分混匀；
2）磁珠比例不对，建议按照说明书进行选择合适的比例；
3）孵育时间不足，保证孵育时间至少5 min；
4）磁珠分选时，二轮磁珠吸附的时候吸到磁珠。可在200 μL 枪头前串联 10μL枪头用于移液，可防止吸到磁珠；
5）磁珠洗涤时的乙醇非现配，导致乙醇浓度过低，建议乙醇浓度不低于70%；
6）干燥过度：磁珠长时间干燥导致表面龟裂，DNA难以洗脱，得率降低；建议干燥时间不宜过长，表面刚出现龟裂即可；
7）洗脱液体积不足：最终洗脱液应完全覆盖管内磁珠。
Q：纯化后DNA在后续实验中表现不理想。
A：由乙醇残留引起，可能是操作时磁珠分离时间过短或磁力器磁力较弱，洗脱步骤中吸取上清速度过快等。建议确保在最后一步洗涤结束后，溶液中无残留乙醇。磁珠可于室温干燥5-10分钟，使乙醇完全干燥。
Q: 使用 12601 分选磁珠，分选出的文库大小不对称是怎么回事？
图5. 分选文库大小不对称效果图
A：操作问题，磁珠比例应严格按照说明书，另外移液时为避免吸到磁珠，底部需残留 1-2μL 液体。
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产品类型 |
名称 |
货号 |
规格 |
价格 |
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回收100-200 bp/100-400 bp |
12599ES03 |
1 mL |
466.00 |
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12599ES08 |
5 mL |
1666.00 |
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12599ES56 |
60 mL |
9106.00 |
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专注DNA小片段的回收 |
12600ES03 |
1 mL |
386.00 |
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12600ES08 |
5 mL |
1386.00 |
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12600ES56 |
60 mL |
7586.00 |
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12600ES75 |
450 mL |
29886.00 |
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完美替换XP |
12601ES03 |
1 mL |
296.00 |
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12601ES08 |
5 mL |
986.00 |
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12601ES56 |
60 mL |
6286.00 |
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12601ES75 |
450 mL |
26186.00 |
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替代柱法纯化RNA |
12602ES03 |
1 mL |
366.00 |
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12602ES08 |
5 mL |
1066.00 |
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12602ES56 |
60 mL |
4266.00 |
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12602ES75 |
450 mL |
38566.00 |
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分离纯化poly（A）尾巴的mRNA |
12603ES24 |
24 T |
616.00 |
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12603ES96 |
96 T |
2266.00 |
HB200526
