研发背景

RT-PCR是常用到的实验手段，cDNA的质量关乎qPCR、PCR等实验的成败。看似简单的实验，但总是不可避免的碰到一些实验问题：

1）RNA浓度低，逆转录效果差，Ct值不理想；

2）RNA具有二级结构或GC含量高导致逆转录失败；

3）逆转录酶的合成长度达不到要求；

4）逆转录时间太长，严重影响实验进度；

5）cDNA质量差，基因扩增失败...

基于以上易出现的实验问题，Yeasen在Hifair^® II Reverse Transcriptase基础上开发了Hifair^® III Reverse Transcriptase，其cDNA合成速度快，热稳定性大幅度提高，可耐受高达65℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。

Hifair® III系列逆转录产品选择指南

产品特点

1、cDNA合成速度快，大大缩减逆转录时间；

2、热稳定性大幅度提高，可耐受高达65℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录;

3、增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录;

产品性能

1、逆转录反应温度达55℃，耐受65℃高温

图1. 逆转录反应温度达55℃，耐受65℃高温。反应温度55℃可满足常规模板及二级结构模板的转录，高GC模板可适当提高到65℃反应。

2、延伸性能优越，可合成长达19.8 kb的cDNA

图2. 最长可合成19.8kb的cDNA。 RNA 投入量为500ng， A、B、C分别为经过 Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（11139）  gDNA消化、gDNA消化跳过、T品牌Kit逆转录后，以cDNA为模板扩增DYNC1H1（19.8kb）的结果。逆转程序为各产品的标准逆转录程序。综上，Hifair^® III Reverse Transcriptase可合成长达19.8kb的cDNA。

3、cDNA合成速度较快，5min内可合成6kb的cDNA

图3. cDNA合成速度较快，5min内可合成6kb的cDNA。以293T细胞的 RNA为模板，按说明书标准程序进行逆转录，逆转录时间按5、10、15、30、45、60min分别进行设置。Hifair® III Reverse Transcriptase 5min内可合成6kb的cDNA，特异性和产量均优于V品牌。

4、适用性广泛，适合不同GC含量、不同表达丰度的基因

图4. 适合不同GC含量、不同表达丰度的基因。针对不同GC含量、不同表达丰度的基因，Hifair^® III Reverse Transcriptase相对市面同类产品ct值更低，具有更高的逆转录效率。

5、宽广的模板线性范围内均可高效合成cDNA

GAPDH：E=98.47%，R²=0.998

RPS2：E=98.79%，R²=0.998

AGTPBP1：E=100.08%，R²=0.998

GLUD1：E=100.35%，R²=0.998

图5. Hifair^® III Reverse Transcriptase在很宽的模板范围内均可高效合成cDNA。 Total RNA投入量为5pg-5μg，逆转录按说明书标准程序进行，所得cDNA对4个基因进行qPCR检测，结果显示扩增效率均在98-100.10%之间。说明在宽广的模板线性范围内均可高效合成cDNA。

6、高效去除基因组残留，让实验结果更准确

Positive control：25ng Mus gDNA作为模板进行qPCR检测。

实验1：25ng Mus gDNA，按说明书标准程序进行gDNA去除后逆转录（gDNA digester具备gDNA消化功能），所得产物进行qPCR检测。

实验2：25ng Mus gDNA，同时加入gDNA digester Mix和Hifair^® III SuperMix处理（注意：该步骤可导致gDNA digester消化gDNA功能失效），按说明书程序逆转录后进行qPCR检测。

图6. 带有gDNA去除组分的产品可高效去除gDNA残留。 试剂盒中的gDNA digester组分可高效去除残留基因组，当加入10×Hifair^® III Super buffer后，消化功能终止，可实现去除RNA模板中gDNA的干扰，保证定量结果准确。

7、RNA最大可投入12μL，有利于低浓度模板检测

产品信息

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翌圣生物成立于2009年，是致力于分子酶创新研发的国家高新技术企业，总部位于上海市浦东新区国际医学园区。公司围绕“解析分子酶结构与功能，拓展分子酶应用场景，解决生命科学领域与精准医疗领域试剂核心问题”为重点，开发分子生物学，高通量测序，细胞生物学及体外诊断相关的酶原料与试剂。秉承客户至上，合作分享，诚信务实，创新奉献的价值观，踏实服务于生命科学以及精准医疗领域。