涨知识，对于PCR你真的知道么？
PCR作为分子生物学最基础的研究方法之一。20世纪80年代凯利·穆利斯发明第一代PCR技术以来，“变性、退火、延伸”三部曲从未停歇。历经三十多年的演变，PCR技术已衍生出众多变体。小翌总结了一代PCR的一些常见类型，助力您的科学研究。
常规PCR
常规PCR一般是由Taq DNA聚合酶介导的PCR反应，操作较为简便，产物带有A尾。通过琼脂糖凝胶电泳对终产物进行定性和半定量分析。兼容样本范围广，但保真性低，主要应用于常规重组质粒验证和基因型鉴定等方面。
常规PCR产品
产品名称：2×Hieff® Robust PCR Master Mix (With Dye)
产品特点：
1）延伸速度快（15-30s/kb），极限速度达5s/kb。
2）模板适用性更广泛，靶基因GC耐受范围35-70%。
图1. 以小鼠基因组为模板，分别扩增1-4kb的片段
高保真PCR
高保真PCR一般是由保真性较高的DNA聚合酶介导的PCR反应。第一代高保真DNA聚合酶是从栖热原始菌Pyrococcus furiosus中获得的具有校正功能的pfu酶，与常规Taq酶相比多了一种3’-5’的核酸外切酶活性（Proofreading活性），保真性大大提高且扩增的产物通常为平末端。目前主要有2类产品：一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶混合用于提高扩增效率；另一类是单一型的高保真酶，保真性更高。
翌圣Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶基于Pfu，经基因工程改造而成。酶溶液中添加了独特的反应增强因子、热启动因子和延伸因子，极大提高了扩增的成功率，特异性和延伸速度。对于高保真PCR应用而言，具有高保真性、高成功率、高特异性的Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶是理想选择。
高保真PCR产品
产品名称：Hieff Canace® Gold PCR Master Mix
产品特点：
1）保真性高，是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。
2）超高特异性。
3）高灵敏：可扩增低至1 pg模板。
图2. 5种品牌的高保真DNA聚合酶扩增2 kb，4 kb的小鼠gDNA。Y：Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶；A-E：其他品牌的高保真DNA聚合酶。
热启动PCR
热启动PCR，也称Hotstart PCR。指通过一定条件将DNA聚合酶与其他PCR反应物隔绝，使其低温条件下无活性，高温加热后释放酶活，进而避免出现非特异性产物的PCR反应。热启动PCR的关键是热启动型的DNA聚合酶，一般通过抗体、配体或化学修饰等来封闭酶活性中心，不同的热启动修饰方法原理上有所区别，各有优劣势（见下表）。通常应用于复杂模板、低拷贝基因扩增，也是IVD试剂的核心原料。
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化学修饰 |
配体修饰 |
抗体修饰 |
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原理 |
低温下，化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合，酶无活性；温度升高至变性温度，两者脱离，酶活性中心暴露，此时，聚合酶发生聚合反应。 |
核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合，进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。 |
高温变性前，抗Taq抗体与Taq酶结合，抑制聚合酶活性。温度升高至变性温度，抗Taq抗体变性失活，聚合酶发生聚合反应。 |
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优点 |
酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比较高。 |
酶激活时间短，保证酶活。 |
酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。 |
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缺点 |
酶激活时间较长，可能会影响酶的活性，导致 PCR 产物的产量降低。 |
核酸配体是一种可逆抑制剂，不如化学修饰法稳定，特异性不够强。 |
抗体修饰是一种动态平衡，不如化学修饰法稳定，价格更贵。 |
热启动PCR产品
产品名称：Hieff UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase (抗体法热启动Taq酶)
产品特点：抗体法修饰，亲和力强，灵敏度高，特异性好。
直扩PCR
翌圣直扩PCR系列产品运用独特的裂解体系，快速裂解样品，裂解液可直接作为模板，搭配试剂盒中的具有超强抑制物耐受性的Taq DNA聚合酶进行基因的高效扩增。
图3.组织直扩系列流程图
小鼠直扩PCR产品
产品名称：Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠组织直接PCR试剂盒
产品特点：
1）样本需要量少：5mg鼠组织或1-5mm鼠尾。
2）模板制备更方便：无需研磨，无需精提纯化gDNA。
3）优化的PCR体系：具有更高的特异性、更强的 PCR 反应抑制物耐受性。
图4.适合不同类型的小鼠粗提组织
多重PCR
多重PCR，也称复合PCR。反应原理、反应过程与常规PCR无异，需要在同一个PCR反应体系中，使用多对引物对多个基因同时进行扩增。理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但实际由于各种条件的限制，实际能够扩增的产物有限。多重PCR反应体系的组成和PCR循环的条件需经过优化以确保同时扩增多个片段。具有高效性、系统性、经济简便性，难点是反应体系各组分的平衡。主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
图5.多重PCR原理图
多重PCR产品
产品特点：
1）扩增子大小：适合50bp-1.5kb的扩增子。
2）均一性好：靶点偏好性极低。
3）特异性强：最大程度抑制非特异性扩增；
4）灵敏度高：可扩增低至1ng模板；
5）扩增重数：可达20-1000重。
图6. 以人gDNA模板，进行10重PCR，可检测低至1ng的模板
巢式PCR
巢式PCR是指利用两对引物进行两轮PCR扩增的反应。首先使用目的片段外围的引物对模板进行扩增，然后使用内部的巢式引物同时将第一轮PCR扩增产物作为第二轮扩增的模板。第二次PCR扩增得到的目的片断短于第一次扩增。翌圣GMyc-PCR 支原体检测试剂盒基于支原体16S-23S rRNA序列保守区域利用巢式PCR法原理可精确检测到常见的支原体污染。主要应用于病毒检测、测序分析、低表达基因检测等。
巢式PCR产品
产品名称：GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原体检测试剂盒
产品特点：检测多种支原体类型，检测限低至单拷贝。
图7. 巢式PCR扩增含不同浓度支原体样品。
降落PCR
降落PCR，又称Touch-down PCR。通过设置PCR程序中的退火温度，一般开始时高于预设的Tm值，随着反应的进行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最终低于该温度进行PCR反应。通过反应程序中退火温度的设置，极大程度上降低了引物与模板的非特异性结合。主要用于PCR反应程序的优化，提高产物特异性。
常见的PCR类型介绍就到这里了。当然，除了上述介绍的PCR形式，还有锚定PCR、原位PCR等不同的PCR类型，如感兴趣可自行查阅或留言哦！
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