最近小翌在后台收到消息,说建库的片段化仪器坏了,不能做超声打断,问有没有其他核酸打断的方法推荐。干货来啦!
核酸打断的方法可以分为机器法和试剂法。
其中机器法包含接触式和非接触式,接触式主要包括探头式和水浴超声两大类,这类方法比较实惠,但是直接接触样本会导致样本损耗和污染,非接触式主要包括Diagennode和Covaris这两个品牌,这类仪器和耗材的成本太高,单个样本的耗材成本达20-50元。
试剂法指的是采用片段化酶对核酸进行打断,这类方法成本较低,操作简便省时,只需要在样本中加入片段化酶,再反应一段时间即可完成反应。市面上报道可用于核酸打断的片段化酶有很多,包括应用于高通量测序的Tn5转座酶、NEB公司推出的Fragmentase、DNase I和Endonuclease V等。这里小翌就借花献佛,将试剂法核酸片段化酶的资料整理出来与大家分享。
DNase Ⅰ
DNase I(Deoxyribonuclease I):中文名称为脱氧核糖核酸酶I,是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物,5'端为磷酸基团,3'端为羟基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依赖于钙离子,并能被镁离子或二价锰离子激活。
常见应用:
在镁离子存在条件下,DNase I随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下,DNase I可在同一位点剪切DNA双链,形成平末端,或1-2个核苷酸突出的粘末端。
图 DNase Ⅰ在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA。图片来源于Thermo
DNase Ⅰ在不同的离子存在下可以片段化dsDNA,然后实际操作中却易受到多种条件的影响,如酶的用量,反应温度,底物DNA的纯度等。此外研究发现DNase Ⅰ对嘧啶核苷酸旁边位点有偏好性,大大影响终文库的多样性[1]。
Endonuclease V
核酸内切酶 V 是在E. coli 中发现的一种 DNA 修复酶。其识别脱氧肌苷(脱氧腺苷在DNA中的脱氨基产物),对错配的脱氧肌苷3´ 端第二个磷酸二酯键进行切割,产生一个 3´ 羟基、5´ 磷酸的切刻。除此之外在较小程度上可以识别AP位点,基因错配的DNA位点,插入/缺失不匹配等位点。
常见应用:
图Endonuclease V可识别AP位点或尿素、碱基错配、插入/缺失错配、发夹结构的 DNA。图片来源于Thermo
2002年,日本学者Kentaro Miyazaki使用Endonuclease V用于DNA样本的随机片段化。由于Endonuclease V可特异性识别尿嘧啶,因而可以通过调节DNA中尿嘧啶的残留量来控制最终Endonuclease V酶切的长度。结果表明在没有dUTP的情况下,DNA不会被酶切(Lane 1),当dTTP/dUTP的比例降低时,片段的平均长度也随之降低(Lane 2,3,4),当dUTP完全替代dTTP的时候,DNA会被切割的很短(Lane 5)[1]。
图 不同的dTTP/dUTP浓度比例条件下,DNA被酶切后的片段分布电泳图
Endonuclease V一般识别特定的位点,本研究中通过PCR随机引入尿嘧啶可用于DNA的随机片段化。由于碱基序列组成的差异,样本的GC含量对Endonuclease V片段化效果有潜在影响,实际操作中尤其是NGS应用中也会受到诸多条件的限制。
dsDNA Fragmentase
dsDNA Fragmentase是NEB公司推出的一款片段化酶,以单酶的形式出售。该产品实际上是两种酶按一定比例组合成的混合酶体系,一种酶在DNA双链上随机产生缺刻,另一种酶识别这个缺刻并在互补链上切割,从而产生DNA双链断裂。Fragmentase进行双链DNA片段化反应后产生带有5’磷酸和3’羟基的短突出粘性末端DNA片段。
该酶通过改变酶切时间将DNA酶切至特定大小的DNA片段,与初始的Input DNA量以及Input DNA长度无关。
图 不同起始量的gDNA不同酶切时间后的片段分布。图片来源于NEB官网
图 不同长度的gDNA不同酶切时间后的片段分布。图片来源于NEB官网
Tn5
NexteraXT技术相信大家都不陌生,2011年1月,Illumina宣布收购Epicentre生物技术公司,于是理所当然的Epicentre公司的Nextera技术核心也归illumina公司所有。
NexteraXT将P5/P7端部分接头序列和转座子末端序列形成包被接头与Tn5形成转座复合体,该复合体会打断受体DNA,形成一端带有P5部分的Adapter1,一端带有P7部分Adapter2的DNA,之后通过PCR加上index序列以及接头其余部分,形成完整的文库,整个建库流程仅需90 min。
图 Tn5转座酶建库原理示意图
Tn5也借此引爆极速建库之战,而竞争对手也并没有坐以待毙,Thermo用Mu转座酶推出了Museek Library Preparation Kit for Ion Torrent;Agilent 推出Vibrio(哈式弧菌),Vibrio与Tn5序列之间的相似性高达40%。尽管如此,其市场反馈以及实际情况都不如Tn5。
同时Tn5由于其片段化的偏好性经常受到竞争对手的诟病。据统计Tn5在插入位点两侧9个碱基左右有明显的偏好性。
图 转座酶插入位置前后9碱基左右有明显的偏好性。图片来源于网络
片段化酶小结
片段化酶与NGS
NGS因其检测灵敏度高,特异性高且兼具定性和定量检测,在NIPT,肿瘤基因突变,PGD/PGS等领域展现了极为广阔的临床与科研应用前景。
然而受限于平台测序读长短的不足,建库前需随DNA进行随机打断。目前主要是以机械法为主(如Covaris),但是超声本就是物理方法打断,会对DNA造成明显的损伤,且超声仪器与耗材成本居高不下,这对竞争激烈的NGS下游服务企业来说,成本太过高昂。因而这也将是以片段化酶+常规建库试剂搭配的酶切法建库试剂盒进入市场的重要契机。
对于不同的片段化酶来说,Tn5依然是目前市场上极速建库的王者,然而另一方面Tn5在建库中所表现出的偏好性也使得不少的客户望而却步。因此像DNase Ⅰ、Endonuclease Ⅴ以及Fragmentase在市场上初露锋芒,其中DNase Ⅰ与Endonuclease Ⅴ因其各自的不足尚未被完全开发利用,Fragmentase则是目前NGS端大众所熟知的片段化酶。
精品推荐
翌圣生物结合自身分子酶的创新研发,推出片段化酶Smearase,本产品酶切效果仅与酶切时间有关而与样本类型GC含量以及Input DNA无关。以此为核心的酶切法建库试剂盒Hieff NGS® OnePotⅡ DNA Library Prep Kit for Illumina摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,极大的降低了建库的时间和成本。并且针对FFPE样本也能获得优异的测序结果。
产品特点:
1、操作简便:片段化/末端修复/加A一步完成
2、稳定酶切:酶切效果仅与时间有关,不受物种类型与Input DNA影响
3、偏好性低:酶切偏好性远低于Tn5
4、适用范围广:不仅适用于常规gDNA,cDNA,还适用于FFPE等样本
性能展示:
图 不同酶切时间后样本片段分布情况
订购/试用装信息
类型 |
名称 |
货号 |
规格 |
价格/元 |
试剂盒 |
12204ES08 |
8 T |
3683.00 |
|
12204ES24 |
24 T |
7583.00 |
||
12204ES96 |
96 T |
28663.00 |
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片段化酶 |
12907ES08 |
8 T |
563.00 |
|
12907ES24 |
24 T |
1263.00 |
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12907ES96 |
96 T |
4663.00 |
参考文献:
Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling. Nucleic Acids Res. 2002 Dec 15;30(24):e139.