你测定的cDNA浓度到底准不准？
小翌最近被很多客户问到如下问题，做RT-qPCR实验时，逆转录之后测得的cDNA浓度低是什么原因？今天小翌就带您全面解答这个问题。
1. 影响cDNA浓度的因素
一般我们评估核酸模板的质量，需要从浓度、纯度及完整性三方面进行考量，但逆转录后的产物是一个混合体系，有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分，会干扰cDNA的吸光度，因此不建议用逆转录后的cDNA来检测浓度与纯度。此外，260nm是核酸吸收峰最高的位置，在这个位置，1OD（optical density，光密度）的吸光度分别相当于50ng/μl的双链DNA，37ng/μl的单链DNA，40ng/μl的RNA，30ng/μl的寡核苷酸（dNTP）。就拿里面的dNTP来说，即使cDNA浓度一样，但dNTP也会严重干扰其测定结果。
为此我们专门进行了验证，可以进一步说明dNTP 投入量对cDNA浓度检测结果存在的影响。以小鼠肌肉组织RNA为模板，采用Yeasen逆转录试剂盒11121ES（dNTP 组分按 1μl / 1.5μl /2μl /2.5μl添加量的梯度检测）、T品牌、V品牌试剂分别进行逆转录实验，RNA 投入量为500ng，逆转录体系及程序分别按各自说明书进行。采用Nanodrop测定cDNA浓度，并取相同体积cDNA分别进行qPCR实验，结果证明：
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不同品牌逆转录产品的cDNA浓度相差较大，但定量实验Ct值几乎一致。
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逆转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异，但最终Ct值几乎一致。
表1. Nanodrop定量结果统计表
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产品 |
浓度（ng/μl） |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 1μl |
916.864/ 920.295 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 1.5μl |
1247.707/ 1235.671 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 2μl |
1603.601/ 1592.303 |
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Yeasen 11121ES+ dNTP 2.5μl |
1784.639/ 1780.047 |
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T品牌 |
756.293/ 759.956 |
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V品牌 |
1055.075/ 1055.137 |
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dNTP（10mM）1μl |
9477.6/9488.6 |
图1.qPCR检测结果△Ct＜1，且 Ct 值与 Nanodrop 定量结果无线性关系
因此，cDNA浓度的测定值是不准确的，逆转录实验之后无需测定浓度。RT-qPCR是一个多步骤连贯实验，正是因为cDNA无法鉴定，只能通过后续qPCR实验才能呈现结果，那如何去尽可能保证可以得到一份高质量的cDNA，从而保证整个实验的顺利进行呢？
2. 如何获取高质量的cDNA
作为RT-qPCR实验的第一步，RNA的质量直接决定定量结果的准确性与可靠性。要获得一份高质量的RNA模板，可从以下几方面进行优化。
1) 样品处理与保存
新鲜采取的样本可进行液氮速冻或用一些特定的RNA样品储存液进行处理，能立即保护样品中的RNA，并灭活内源RNase。样品用液氮瞬间冻结之后，应储存在-80°C，不能进行解冻，否则将导致RNA的降解和损失。而用RNA样品储存液进行处理的样品，保存条件则相对宽泛，长期保存可置于-20°C以下，短期保存可置于4°C。
2) RNA提取
RNA的提取方式分为柱式提取和非柱式提取（如Trizol）。柱式提取法去除蛋白及其他杂质干净，提高了RNA的纯度，但非柱式提取的方法RNA的得率则相对较高。环境中的RNase几乎是无所不在，所以在整个RNA提取与后续逆转录过程中，用到的吸头、离心管、移液器、各种溶液、工作台等等，必须确保无RNase污染。除去传统的DEPC浸泡法，还能加以使用表面去污净化溶液如RNase喷雾清除剂来进行处理。
3) RNA储存
纯化的RNA应溶于无RNase的水中储存，储存温度在-20°C或以下。最好将核酸模板分装成小份保存以减少反复冻融。模板解冻完全后轻弹混匀后再使用。
4) RNA逆转录
①选择合适的逆转录引物
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逆转录引物选择指南 |
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特征 |
优点 |
缺点 |
结合方式 |
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Oligo (dT) |
1）12-20个T； 2）与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对。 |
可合成全长cDNA。
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1）仅扩增有poly A尾的mRNA； 2）对模板质量要求高。 |
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Random Primers |
1）6-9个碱基； 2）可随机识别模板并结合。 |
适合复杂结构和微量模板。 |
特异性低，小片段多。 |
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基因特异性引物（GSP） |
识别特定模板序列。 |
特异性强，灵敏度高。 |
仅合成特定的序列，不适合研究同一个样本中多个基因。 |
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②选择合适的逆转录酶
对于逆转录酶的选择，目前科研领域常用的逆转录酶主要有AMV， MMLV，以及基于这两种酶改造的其他逆转录酶。Yeasen Hifair酶经过分子改造后，缺失了MMLV原有的RNase H活性，避免了模板RNA的降解；同时具有更高的反应温度，针对一些高GC含量，以及富含复杂二级结构的RNA模板具有更强的逆转录效率。
图2. Hifair酶缺失了RNase H活性，对复杂模板具有更强的逆转录效率
掌握了以上要点，终于不用纠结cDNA浓度了吧？
小翌在此给大家介绍下翌圣的逆转录相关产品。
翌圣逆转录产品选择指南
小翌强烈推荐Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase，该酶具有逆转录效率出色、延伸性能优越、RNA线性检测范围广等优势，助力您合成高质量的cDNA。
① 出色的逆转录效率，适合不同 GC 含量、不同表达丰度的基因
图3.以300ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用11141ES、T品牌合成cDNA。取1μL cDNA为模板, 使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增20个不同GC含量（25-65%）、不同表达丰度的基因。
② 优越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
图4. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板，oligodT为引物，使用11139ES合成cDNA。 取1μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.9kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder。
③ 线性检测范围广，Total RNA 10pg-5μg
图5. 以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板，使用11141ES合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。
翌圣逆转录产品荣登过的高分杂志（部分）
1. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
2. Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3.(IF13.493)
3. Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
4. Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotes cell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
5. Tao L, Yi Y, Chen Y, et al. RIP1 kinase activity promotes steatohepatitis through mediating cell death and inflammation in macrophages[J]. bioRxiv, 2020.( IF10.717)
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