环介导等温扩增（LAMP）是一种简单而高效的DNA扩增检测方法，以其特异性强、灵敏度高、快速、准确、简单等特点，在疾病诊断、转基因食品检测等分子POCT领域应用越来越广泛。LAMP技术核心酶—Bst DNA聚合酶的性质，包括聚合活性、链置换能力和热稳定性，在LAMP技术的反应速度和准确性方面起着决定性的作用。

翌圣镁孚泰生物持续专注于酶分子改造研究，依托国家重点研发计划课题一“高性能等温扩增核心酶与量产工艺开发”（课题编号：2022YFF0710101），我们与中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（以下简称“苏州医工所”）展开了深入合作，利用荧光激活微液滴分选（FADS）技术，对Bst DNA聚合酶进行了定向筛选，成功进化出了耐热Bst DNA 聚合酶。

苏州医工所长期致力于酶分子改造及超高通量酶筛选技术，自主搭建了FADS平台（图1）。包括光学系统、电路控制、信号采集和微流控模块。针对微流控模块，该团队设计并制造了三种类型的芯片：液滴生成（图1b）、微注射（图1c）、液滴检测与分选（图1d)。基于液滴微流控技术，该平台能够在单细胞水平上筛选大型突变文库，每天的筛选通量超过1000万个突变体。

图1. FADS超高通量酶筛选平台。a、该系统主要由光源、信号发生器、电压放大器、数字电源、光电倍增管（PMT）、信号采集卡、高速摄像机组成。b，液滴生成芯片。c，电场触发的皮升注射芯片。d，荧光激活的液滴分选芯片。

与此同时，翌圣镁孚泰生物的科研人员利用自身丰富的酶应用及改造经验，设计了基于链置换活性筛选探针的Bst DNA聚合酶超高通量筛选方案，并在FADS平台实现应用（图2）。通过半理性设计、随机突变和DNA重组的方式，分别建立Bst DNA聚合酶的突变库，并将其以单细胞的形式包裹到微液滴中。经过三轮的筛选（图3），成功富集到阳性突变体M2和M3。

图2. Bst DNA聚合酶FADS分子改造示意图。a，通过半理性设计（不同颜色代表不同的氨基酸突变）建立多位点饱和突变库。b，在第一轮筛选的阳性突变体的基础上，建立随机突变库以提高热稳定性（红点代表上一轮筛选的优秀突变位点，其他不同颜色的点代表其他不同氨基酸的突变）。c，对第二轮筛选中的突变体进行DNA重组（红点代表前几轮筛选中获得的优秀突变位点）。d，经过三轮筛选，我们成功地分离出了具有更好的热稳定性和链置换能力的突变体。e，将文库转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。在IPTG诱导后，每个细胞包含各自不同的Bst DNA 聚合酶（不同的颜色代表不同的突变体）。f，当单个细胞被反应体系包裹时，液滴中的荧光缺失，这是由于引物上存在一个猝灭基团。g，裂解试剂破坏细胞结构，导致Bst DNA聚合酶的释放，用于链置换反应。随后，引物被替换，导致液滴发出荧光。h，在FADS分选系统中阳性液滴被富集。

图3. FADS系统的建立和筛选过程。a，不同时间段培养的细胞在微反应器中亮场和荧光图像。b，表达WT和突变文库的微反应器亮场和荧光图像（孵育30 min）。c，第1轮进化阳性菌株的富集。d，第2轮进化阳性菌株的富集。第3轮进化阳性菌株的富集。

随后，苏州医工所团队基于工程化突变体成功研制出专用LAMP试剂反应体系（图4）。实验数据显示，该突变体在55℃恒温条件下将特征峰出现时间由35分钟提前至10分钟以内，且在常规温度区间内的反应速率均显著优于进口N*的Bst 2.0体系。突破性的是阳性突变体展现出70℃极端温度的耐受性，据此联合团队建立起首创性高温LAMP（HT-LAMP）检测技术，为解决传统LAMP检测中顽固性假阳性难题提供了创新方案。研究还创新性开发出基于Bst DNA 聚合酶阳性突变体的冻干型LAMP试剂，相较于野生型Bst DNA 聚合酶，突变体将试剂的贮藏稳定性提升两个数量级，在50℃加速储存条件下仍能维持半年以上活性稳定性。这些突破性进展使Bst DNA 聚合酶突变体成功蜕变为LAMP技术领域中极具应用潜力的核心酶组分。

图4. Bst DNA聚合酶突变体在LAMP检测中的表现。a，Bst DNA聚合酶突变体在不同温度下的LAMP检测中的表现。b，与NEB的Bst DNA聚合酶（绿色）相比，突变体M2（橙色）和M3（红色）在不同温度下对不同靶点的活性显著提高。c，M2在假阳性实验中的表现。d，M3在假阳性实验中的表现。e，Bst DNA聚合酶突变体在50℃热加速实验中的表现。

最后，科研人员对突变体进行分子机制解析，发现了提高链置换活性的新机制，提出了“疏水刀刃”的假说，为进一步提高Bst DNA聚合酶链置换活性提供了理论指导（图5）。

图5. Bst DNA聚合酶的结构分析。a，显示了Bst DNA聚合酶的亚结构，并描述了其与模板和引物的结构位置（PDB：3TAN）。b，N204R突变前后的结构变化。c，I359L突变前后的结构变化。d，F445I突变前后的结构变化。e，E461K和N462K突变前后的结构变化。f，D428K和Y429W突变前后的结构变化。

综上所述，联合团队首次将超高通量微液滴筛选技术应用到Bst DNA聚合酶的进化中，成功筛选出高活性突变体，应用到LAMP体系中，极大地缩短了LAMP反应的出峰时间，提高了酶的热稳定性，确保了酶的长期稳定保存，从而实现了从野生型酶到有应用价值的商品酶的跨越，也充分展示了FADS技术在分子酶高效进化中的巨大威力。

该研究成果以“FADS-Based Directed Evolution of a Robust Bst DNA Polymerase Adapting High-Temperature Loop-Mediated Isothermal Amplification (HT-LAMP)”为题，发表在生物催化领域的顶级期刊ACS Catalysis上（中科院1区TOP，影响因子11.3）。苏州医工所李晓、翌圣生物唐琼卫博士为该论文第一作者，马富强研究员、尹焕才研究员和刘想博士为通讯作者，该研究得到了国家重点研发计划、中国科学院青年创新促进会、江苏省社发项目、山东省重点研发计划、苏州市基础研发试点项目等多个国家级、省部级项目的支持。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c07614