实验室养细胞的小伙伴，是不是遇到过细胞养不好的情况？胎牛血清（FBS）作为细胞培养里最关键的一项组分，对细胞培养的状态起着至关重要的作用，因此我们总结了一些使用中要注意的各种tips供大家参考，记得收藏哦。

胎牛血清常规储存在-20℃即可，但如果想长时间储存可以保存在-80℃，尽量不要多次冻融。如果确定要溶解多次，最好按照每次用量先提前分装，分装后再一起冻存，用时按需解冻即可，或者直接采购小规格50 mL，使用方便快捷。

解冻时候推荐从低温中取出后，放置于2-8℃冰箱中解冻（可过夜），使其部分溶解，然后在室温条件下使其全部融解，溶解过程中须不时的摇动瓶身，混合里面的液体。建议采取此种方式解冻，可有效降低沉淀的产生。不建议直接从低温拿到25-37℃环境中解冻，容易产生絮状沉淀，并且在25-37℃环境中滞留的时间越长，越容易影响血清中一些物质的活性，继而影响细胞培养状态、增殖速率等。

血清中出现的沉淀物质可能包括纤维蛋白（絮状沉淀）、脂蛋白、冷凝集素、玻连蛋白、胎球蛋白、磷酸钙与草酸钙（显微镜下小黑点沉淀）及胆固醇等。

图1  纤维蛋白形态图

这是最常见的沉淀物之一，体积较大，可达1-2 mm，肉眼可见。纤维蛋白的形成主要是由于血清中的纤维蛋白原在解冻后凝结。纤维蛋白是形成凝血的蛋白质之一，通常以絮状沉淀的形式出现，可以通过离心的方法去除。（比如400~600 g离心5 min，取血清上清液。）

图2 .磷酸钙结晶形态图

这种沉淀物会使血清浑浊，并且在37℃培养时会增加。磷酸钙在显微镜下观察像小黑点，有时会被误认为是微生物污染。

图3 .草酸钙结晶形态图

草酸钙沉淀物在血清中的形成与草酸和钙离子的结合有关。草酸是一种有机酸，当它与钙离子结合时，会形成不溶于水的草酸钙沉淀物。

如果需要去除沉淀物，可以采用离心的方法。例如，将血清分装至无菌离心管内，以400-600 g离心5 min，取上清液使用。不建议过滤去除沉淀物，因为这可能会阻塞过滤膜或导致营养成分流失。

产品沉淀的原因较多，主要有以下几种：

(1) 温度变化：血清在解冻过程中如果温度变化过大(如从-20℃直接放入37℃), 容易产生沉淀物。

(2) 反复冻融：反复的冻融过程会导致沉淀物的增多。

(3) 热灭活：热灭活血清会显著增加沉淀物的形成。

(4) 长时间储存：血清在室温或低温冰箱中放置时间过长，不稳定成分会被破坏，导致沉淀物的产生。

沉淀物本身不影响血清质量，不会直接影响细胞的生长和增殖，只是沉淀如果覆盖到细胞上面形成一层膜，可能会影响细胞对于营养物质的吸收，所以如有需要，把血清加入到培养基后，离心去除沉淀即可。

血清出厂前都经过严格的无菌处理和质检，如果单从细菌这一块考虑的话，是不需要额外过滤的，如果考虑到沉淀物，可以采取400-600 g离心5 min去除沉淀，必要时候可以加入培养基后，再一起过滤，尽可能减少对于营养物质的损耗。

待细胞长到密度80%左右可进行细胞消化（不要等到过密再消化，此时细胞状态可能会受影响），先用PBS润洗细胞2-3次，同时将配置好的胰酶（一般0.25%的浓度）置于37度培养箱中预热一段时间（这个对消化很有帮助），一般T25培养瓶中加入1 mL胰酶消化（如有需要也可以加到1.5 mL），然后将加了胰酶的培养瓶置于37度培养箱中消化，大部分细胞消化2-5分钟左右，大约90 —120 min左右，可取出，显微镜下观察细胞状态，细胞是否变得松动，呈现圆圆的分散状态，同时可轻拍培养瓶侧面（一定要轻柔），可让贴壁细胞更快的脱落。若细胞还未变成圆圆的状态，则继续放回培养箱消化，若细胞状态已经变成了松散的圆形了，则加入含血清的培养基终止消化，并且800 rpm，离心3 min收集细胞。不要等到细胞全部变圆后再终止，此时可能容易消化过度，在中间可借助轻拍侧壁加速消化。

首先血清培养加入比例一般是10%（90%培养基（如DMEM）+10%胎牛血清），部分细胞可能是5%或者15%进行调整，部分原代细胞可能使用20%的添加比例，具体情况可以具体实验去摸索调整。

如果一直使用一种血清品牌，突然直接更换其他品牌，很容易出现细胞增殖变慢或者直接死亡的情况，哪怕是更换了性能更好品质更高的血清，也可能会出现这种情况，但并不代表这款血清品质不行，而是细胞适应了以前的环境和代谢，你突然打破了这种平衡，它短时间适应不了，所以必须要科学的驯化细胞去适应新的环境，因此建议梯度替换。

建议复苏细胞还是用原品牌血清，传代1-2代，代细胞培养状态稳定后，新血清按照25%占比（新血清：原血清=1：3）进行第一次换液，第二次换液50%占比，第三次换液75%占比，再到100%的占比逐步替换原血清，中间实时观察细胞状态，待细胞状态稳定后再进行新的比例替换。细胞密度：保证细胞处于对数增长期，按照1:2或者1:3的传代，维持较高的细胞密度。

镜下培养中出现“小黑点”的原因很多，可以大致按照这几点进行分析和排除：

1. 细菌污染：早期看到微小颗粒，后期可见移动的小黑点，并且培养液变得浑浊，变黄等，则怀疑是细菌污染；

2. 真菌污染：早期看到小黑点，后期可见菌丝结构，则小黑点可能是酵母或霉菌的孢子，怀疑是真菌污染；

3. 细胞碎片：可能出现细胞碎片，在镜下看起来像移动的“小黑点“，其实是细胞状态恶化产生的细小碎片。碎片产生原因较多，有可能是细胞消化过程中用力过猛产生了机械损伤，也有可能是细胞过密、营养不足引起的细胞凋亡，还有可能是支原体污染导致细胞状态不佳，产生的细胞碎片。

4. 血清沉淀：胎牛血清（FBS）中的纤维蛋白或磷酸钙等成分解冻后形成沉淀，显微镜下为均匀分布的黑色颗粒。

5. 培养器皿/试剂污染：培养器皿残留杂质；培养基、胰酶等试剂中含有颗粒物。

6. “黑胶虫”现象：一种非微生物污染的颗粒物，可能来源于血清、水或环境中的纳米级污染物，可随细胞移动。

1.显微镜观察：

2.培养液状态：

3.传代验证：

对于大多数细胞的培养而言，是不需要加热灭活的。但在免疫学研究、胚胎干细胞（ES细胞）培养、昆虫细胞和平滑肌细胞培养时推荐使用灭活血清。加热血清可以使补体去活化，但同时也会破坏热不稳定的蛋白。热灭活血清对细胞的生长只有微小的促进作用，甚至会因为灭活不当，破坏血清的品质，而抑制细胞的生长。如确实需要灭活血清，则将血清严格置于56℃环境中，加热30 min进行灭活，在血清的加热和灭活过程中需要不断地进行摇晃混匀。