双荧光素酶报告基因检测系统是指以荧光素（luciferin）和腔肠素（coelenterazine）为底物，检测萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海肾荧光素酶活性的一种双报告系统。萤火虫荧光素酶作为报告基因，催化luciferin 氧化成oxyluciferin，在luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光；海肾荧光素酶作为内参基因，催化coelenterazine 氧化成coelenteramide，在coelenterazine 氧化的过程中，同样也会发出生物荧光。通过荧光测定仪测定反应过程中释放的生物荧光或使用酶标仪来检测荧光素酶活性的变化。

图1.荧光素酶生物发光化学反应示意图

双荧光素酶系统（Firefly & Renilla Luciferase）是基因调控研究的“黄金搭档”，通过双信号校正技术，可有效消除实验误差（如细胞数量、转染效率等干扰），显著提升数据稳定性和灵敏度。

双荧光素酶验证转录因子与启动子区调控作用

转录因子是一类参与基因转录调控的重要调节因子。不同转录因子的DNA 结合结构域识别不同基因启动子区特定的碱基序列，行使抑制或激活该基因转录的功能。如图3，将目的基因启动子区域（通常取转录起始位点TSS 上游-2000bp）、或针对结合位点进行突变、或分段截断序列，构建到报告基因载体luciferase 的上游，共转染转录因子过表达质粒，通过荧光素酶活反映转录因子对启动子活性的调控作用。

常用载体：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter

1）转录因子NC + 启动子对照质粒 + 海肾内参质粒；

2）转录因子NC + 启动子野生型质粒 + 海肾内参质粒；

3）转录因子NC + 启动子突变型质粒 + 海肾内参质粒；

4）转录因子质粒 + 启动子对照质粒 + 海肾内参质粒；

5）转录因子质粒 + 启动子野生型质粒 + 海肾内参质粒；

6）转录因子质粒 + 启动子突变型质粒 + 海肾内参质粒。

1、启动子报告基因载体构建：将目的基因构建至双荧光素酶报告基因载体的上，目的片段位于荧光素酶报告基因的上游，如构建至pGL3-basic。
2、转染细胞：将荧光素酶报告质粒与内参报告质粒和共转染目的细胞，由于内参的启动子活性较强，通常报告质粒与内参质粒的转染比例为10:1。
3、收集细胞：将裂解液加入细胞孔中，摇床常温条件下摇晃适当时间后进行离心，将上清转移到新的管子中。
4、双荧光素酶报告基因活性检测：96 孔酶标版中加入20 ul细胞裂解液上清，加入100 μL萤火虫萤光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。加入100 μL海肾萤光素酶反应液，震板混匀，检测海肾萤光素酶的活力，检测尽量在30 min内完成。。
5、数据处理：首先将Firefly luciferase/Renila luciferase得出比值，即可得到不同处理组的相对luciferase活性。

（1）转录因子促进靶基因启动子区转录活性

（2）转录因子抑制靶基因启动子区转录活性

无论是基础研究还是药物开发项目，我们的双荧光素酶报告基因检测服务都将成为您探索基因调控机制的强力工具。