随着分子生物学研究的不断深入，分子克隆技术也随之更新迭代，从传统的依赖限制性内切酶的方法发展到如今的TA克隆、TOPO克隆、无缝克隆等等，新的技术不断涌现，为分子生物学的发展和进化提供新的力量。

但有时候选择多，反而让人头大！

市面上最常用的TOPO克隆与同源重组克隆，到底应该选择哪一个克隆技术用于自己的实验呢？今天小翌就来给各位科研er们科普一下二者之间的区别。

基于拓扑异构酶I（Topoisomerase I）的DNA克隆方法，该酶同时具有限制性内切酶活性和连接酶活性，能够识别特定DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA，使得Topo酶与3'末端形成共价键。在连接反应中，受插入片段的5'端羟基的攻击，磷酸键释放能量。利用该能量，插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起，Topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。

TOPO克隆原理

目前市面上的产品，需根据DNA片段末端的不同，选择不同的TOPO克隆试剂盒。如果高保真酶扩增片段，获得的片段即为平末端，可以选择TOPO-Blunt试剂盒（翌圣Cat#10909ES、Cat#10910ES）。如果Taq酶扩增片段，获得的片段即为粘性末端，可以选择TOPO-TA试剂盒（翌圣Cat#10907ES、Cat#10908ES）。翌圣新一代兼容型TOPO-TA/Blunt克隆酶（Cat#10906ES），可以无视扩增后片段末端的区别，室温反应5 min即可连接上TOPO载体，阳性克隆率接近100%。

翌圣兼容型TOPO克隆原理

基于同源重组酶的定向克隆技术。首先将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在同源重组酶（T5核酸外切酶切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶通过15-25 bp的同源序列互补配对，Taq连接酶修复缺口）的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。

同源重组原理

同源重组酶可连接单片段或者多片段，根据插入片段数的不同，选择不同的一步法快速克隆试剂盒。翌圣的Hieff Clone®系列一步法克隆试剂盒，最快仅需50℃反应5 min即可转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95%以上。其中，翌圣10911ES试剂可连接单片段，该试剂盒已发文章累计IF达到1000+。10923ES试剂可连接1-7片段，最长连接片段可达27 kb，是多片段连接的不二之选。值得注意的是，同源重组技术同样可以无视扩增后片段末端的区别，直接进行载体、片段连接。

翌圣单/多片段克隆连接原理

翌圣Hieff Clone^® TOPO克隆系列试剂，仅需添加100 bp-5 kb目的片段，室温反应5 min，即可完成克隆，且无需蓝白斑筛选。

翌圣Hieff Clone^®一步法克隆系列试剂，仅需添加线性化载体、目的片段，50℃反应5-50 min，即可完成1-7片段的一步克隆。

那么两种克隆技术都是载体和片段的连接，应该如果选择呢？

小翌建议大家可以根据应用场景的不同，选择不同的克隆试剂盒。

• 浙江大学：100 bp-500 bp粘性末端连接，阳性率100%！

• 同济大学：10923ES连接3片段，阳性率100%！