新手必看！Nanopore 与 Pacbio，三代测序技术解析入门指南！
近几年，二代建库测序周期已经得到飞速提升，同时第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势，但第三代测序技术自2008年以来也发展的如火如荼，凭借其独特的长读长优势且测序过程无需进行PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，已广泛应用于基因组拼接、病原体研究和突变鉴定等多种方面。
三代测序之原理篇
第三代测序技术又称为单分子DNA测序，即通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的。目前商业化主流的三代测序技术是Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，其中SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。
三代测序之应用篇
目前长读长测序的三代测序平台，已广泛应用于复杂动植物基因组、微生物基因组、全长转录组、微生物群体研究及人类基因组变异检测等领域的科研项目中，以解决这些科研领域检测技术瓶颈的问题。在临床疾病检测方面，三代测序技术在基因组结构变异、短串联重复/微卫星、甲基化检测等遗传病及肿瘤基因检测相关领域具有独到的优势，目前基于三代测序技术的遗传病基因诊断产品层出不穷。
三代文库制备之DNA/RNA QC
提取后DNA/RNA的质量会影响文库制备，因为选择不同的提取方法，DNA/RNA样品中会有不同的化学试剂残留可能抑制酶的活性，同时DNA/RNA的完整性影响下游文库制备效率，进而影响测序质量。
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纯度：DNA/RNA纯度较高，无RNA或DNA、蛋白质污染（需专门适配长片段提取试剂盒）；
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浓度：大于等于30 ng/uL；
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完整性：无降解，DNA脉冲场凝胶分析测量的平均片段大小>30kb，RNA RIN≥8；
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样品量：DNA大于等于1 μg（不同数据量需求略有不同）；
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建议使用TE缓冲液长期储存高分子量（HMW）gDNA。
三代文库制备之数据质控
不同于二代测序的碱基质量标准Q20/Q30，三代测序由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。最直接的方法是看长度。长度短的测序数据不一定差（与文库大小有关），但差的数据长度一定短。在上游测序，最关键的影响因素是文库的构建。高质量的文库产出的数据长度长，质量好；而低质量的文库产出的数据长度短，质量差。
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PacBio 测序数据QC：数据产出（G）、酶读长、插入片段长度、subreads N50
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nanopore测序数据QC：数据产出（G）、平均读长、平均质量值（Q）、Read length N50、最长reads长度及质量值，最重要的两个指标为长度分布与平均Q值。
翌圣生物匠心研发多款适配Nanopore平台的建库试剂盒满足众多客户的不同需求，助力科学研究和临床检测更精准、更快捷！
翌圣三代建库产品选择指南
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产品类别 |
产品名称 |
货号 |
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连接法建库 |
13301ES |
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末修加A模块 |
Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT |
13302ES |
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Barcode接头连接模块 |
Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT |
13303ES |
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马达蛋白接头连接模块 |
Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT |
13304ES |
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片段化/末修/加A模块 |
13309ES |
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长片段高保真扩增酶 |
Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix |
17228ES |
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配套建库产品 |
Hieff NGS® DNA Selection Beads 分选磁珠(完美替代AMPure XPBeads) |
12601ES |
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1×dsDNA HS Assay Kit |
12642ES |
