干货 | 收藏夹吃灰系列之克隆典型案例分析
听说没有，听说没有，最近有一款克隆试剂听上去挺火的呀！
你说的是翌圣一步法快速克隆（Cat#10923ES）？
对对对，就是它，克隆阳性率高，上至7个连接片段，下至6 μL连接体系，你可以想不到，但它都可以做到！
这么牛嘛，有具体的实验案例吗？
那就让我们一起来看看大家是怎么成功获得阳性克隆的吧~
单片段典型实验案例分析
来自同济大学A课题组
实验要点
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实验思路设计完整。
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载体线性化完全，载体、片段均纯化。
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载体：片段的摩尔比1：2。
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连接反应时间50℃，10 min。（小翌家的10923ES单片段连接也可快至5 min，欢迎尝试~）
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实验严谨且验证充分，菌P、测序均验证。
实验亮点
在10 μL小体系下，通过10923ES克隆试剂盒成功构建了单基因过表达载体，阳性率可达100%。
多片段典型实验案例分析
来自同济大学B课题组
实验要点
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实验思路设计完整。
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载体线性化完全，载体、片段均纯化。
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载体/片段摩尔比为该实验者经验累计，由1：2调整为1：1和1：3。小翌依旧推荐载体：片段的摩尔比1：2。
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连接反应时间50℃，30 min。（此为4片段连接标准时间，小翌严选推荐！）
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实验严谨且验证充分，菌P、测序均验证。
实验亮点
4片段+载体连接成功，克隆数优于竞品，阳性率100%。片段中包含高GC序列、3×flag标签，片段投入量小于50ng，连接难度较大。
看了以上两位同学的实验结果，你是否也心痒难耐，想要一展身手！
要想获得成功的实验结果，严谨的实验设计思路和适合的实验方法是重中之重。小翌强烈推荐Hieff Clone®系列克隆试剂盒（Cat#10923ES），为您的实验保驾护航！那么实验记录表也是必不可少的，既可以帮助大家记录实验细节，也能通过记录表复盘实验思路，事半功倍！小翌根据自己做实验的经验总结了实验记录本格式，放于文章最后，小伙伴们可自行取用~
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载体大小 |
bp |
片段大小1、2、3... |
bp |
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载体酶切位点 |
（如果为反向PCR，可不填） |
片段含同源臂的引物序列 |
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可通过翌圣无缝克隆引物设计软件（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）进行引物设计 |
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线性化载体纯化方式 |
片段纯化方式 |
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载体浓度 |
ng/μL |
片段浓度 |
ng/μL |
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载体投入体积 |
μL |
片段投入体积 |
μL |
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推荐翌圣官网—支持中心—生物计算器—克隆连接投入量计算板块，输入片段数、浓度、大小，即可获得投入量：https://www.yeasen.com/calculator.html#/cloning-link/ |
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反应条件 |
温度 ℃、时间 min |
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感受态转化步骤 |
如：小翌的快速感受态细胞 1、提前15 min将LB平板放到37℃培养基中预热。 2、将F-DH5α感受态细胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）从-80℃拿出迅速插入冰上，待菌体融化，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻弹匀，冰浴静置5 min。 3、用200 μL移液枪将上一步的混合物转移到已经37℃预热的LB培养基上，均匀涂布。 4、将平板置于37℃培养箱倒置过夜培养。若进行蓝白斑筛选操作，平板在37℃至少倒置培养15 h。 |
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挑单菌落 |
用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混匀（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接进行PCR反应。共计挑 个单菌落，阳性率 （阳性条带数/单菌落个数）。 |
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测序 |
（推荐使用一条载体通用测序引物+目的片段另一端引物送去测序验证） |
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明星产品推荐
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克隆实验流程 |
产品定位 |
名称 |
货号 |
规格 |
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载体、片段制备 |
高保真PCR |
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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同源重组 |
1-7片段一步法定向连接，最快5分钟完成重组反应 |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
20 T/50 T |
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转化 |
5 min快速完成感受态转化 |
F DH5α化学感受态 |
10×100 μL |
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菌落PCR |
快速PCR升级，可菌P且适用复杂模板扩增 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix |
1 mL/5×1 mL |
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目的片段保存、测序 |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 |
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |
