有时候，qPCR实验会成为阻碍你课题顺利开展的强势拦路虎！看似简单的基因表达量差异验证，当遇到低丰富表达的基因时，也许就举步维艰。模板获取困难导致的RNA提取量少或RNA质量不佳，即使选用最佳的试剂、筛选出最良好的引物，也有可能qPCR定量得到的内参基因CT值在18-20个cycle，而目的基因在31-35个循环。遇到这种情况，你是怎么解决的呢？

qPCR在低丰度表达基因定量中的局限性
 

基因的丰度是指基因在基因组中的绝对拷贝数。可分为高丰度，中等丰度和低丰度。低丰度是指目的基因在基因组中的拷贝数低,可简单认为2ng 总RNA中低于100个拷贝数的基因。从qPCR实验结果来讲，当扩增效率为100%，模板加入量在1-10ng范围内，qPCR得到的CT值高于28时即可认为低丰度基因,如下表所示。

 

对低丰度表达和超低丰度表达的基因进行qPCR实验，会出现两个难点：一是如何保证定量结果的准确性；二是如何对得到的结果进行数据分析。
 

如何定量好低丰度目的基因？

定量结果的准确性需要依赖定量实验的合理设计。低丰度基因定量实验常常出现以下情况：样品复孔间重复性差（见下图）、PCR扩增效率低不能有效反映或接近基因的实际表达量。

 

一、如何保证定量结果的准确性

a. 保证复孔间的重复性
低拷贝基因在总RNA中的分布极不均匀，容易引起复孔间的误差，造成重复性差。

建议：
1、在保证仪器等设备校准的情况下，可以增加cDNA的稀释倍数，增加上样体积，减少移液误差；
2、增加复孔数，对偏差较大的数值予以舍弃；
3、还有一种方法就是引入一种不相关的carrier DNA(or RNA), 这些物质不跟目标基因发生反应，不干扰基因的检测，减少移液过程中靶基因粘壁或枪头的损耗。

b. 保证引物的扩增效率
qPCR扩增效率的要求是在90-110%。理论上，每对引物均需要预实验进行标准曲线确认扩增效率，说到底qPCR反应包含模板，引物和反应试剂，因此可从以下角度优化扩增效率：
1、模板质量的要求：模板纯度低，含抑制剂会抑制PCR扩增，不利于qPCR实验的进行。模板发生降解，引物无法有效退火到目标区域，也会造成扩增效率下降。高质量的模板从来都是进行qPCR实验的要求之一！
2、优化引物设计：常见的引物设计原则可自行百度。非特异性扩增会竞争消耗引物和Taq酶，也会降低目标基因的扩增效率。引物二聚体可参照下一条介绍。
3、引物浓度优化：引物浓度高，模板浓度过低，会引起引物二聚体的形成。对于低丰度基因而言，引物二聚体与SYBR Green I结合产生的荧光，会干扰背景值，造成试剂检测灵敏度下降！
4、试剂的选择：选用特异性好，检测灵敏度高的qPCR预混液。当然，相对于二步法qPCR定量而言，选取一步法RT-qPCR无疑会有更好的灵敏度，该方法将反转录和qPCR置于一管，增加了检测的灵敏度。

 

二、如何对定量结果进行分析

下面我们从扩增效率角度和内参基因与目的基因△CT值的差异进行解释低丰度基因定量数据的评判标准。

a.当内参基因和目的基因的扩增效率一致，且扩增效率均接近100%：

1、内参基因和目的基因的△CT值相差较大时，如内参基因Ct值在20，目的基因Ct值在32。

当遇到以上情况，且实验的样本材料较珍稀或RNA纯化量较少，可考虑以下分析方法。

 

首先构建质粒标准品，做标准曲线，测定TNF（目的基因）和HPRT（内参基因）扩增效率，如下表。

 

由上表可以看出，内参基因与目的基因的△Ct值相差均匀，表明扩增效率接近。

 

当研究“Jurkat cells were untreated or treated with PMA”，TNF表达量计算如下表：

 

可以看出，以上数据直接按照正常的△△Ct法分析即可。该分析方法的前提是qPCR试剂可准确定量超低浓度模板量。

 

2、内参基因和目的基因的△CT值相差较小（适用于样本RNA量多时）

当选用的qPCR试剂检测范围较小时，对低浓度模板不能准确定量，可增加模板加入量，使内参基因和目的基因均在试剂检测的有效范围。此时的关键在于选择表达丰度和目的基因相近的内参基因。内参基因的选择依据有二：一是不受作用因素的影响且表达量相对恒定；二是选取多个内参基因，均一化误差。下表列举了常见的内参基因，丰度从高到低，根据目的基因表达丰度选取1-3个进行对照校正。

 

 

b.内参基因和目的基因的扩增效率不一致，但均在90%-110%之间——双标准曲线法

利用双标准曲线法计算基因的相对表达量。

 

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