上新 | 热稳定、低宿主残留的RNase HII来咯!
RNase HII是一种核糖核酸内切酶,识别DNA-rN-DNA/DNA双链,在DNA掺入核糖核苷酸的位点进行切割,但对单链RNA切割活性极低,对dsDNA、ssDNA无切割活性。RNase HII在50°C~75°C间具有活性,在70~75°C具有最佳活性。RNase HII作用时,在单核糖核苷酸残基处从 5’端进行切割,切割后产生一个 5′ 端磷酸基团和一个 3′ 端羟基(图1)。由于RNase HII具有在DNA掺入核糖核苷酸位点进行单点切割且对dsDNA、ssDNA无切割活性的特性,RNase HII常用于启动反应(引物激活并延伸)的“开关”,从而实现特异性扩增,在RNase HII依赖性PCR(rhPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等应用广泛。
rhPCR是在常规聚合酶链反应(PCR)的基础上增加了Rnase HII和封闭式可切割rhPCR引物,消除了反应过程中引物二聚体的形成,极大减少了错误扩增的出现,显著提升了反应的特异性、灵敏度和重复性,在单核苷酸多态性(SNP)、基因分型、多靶标同时检测、环境核酸检测等方面具有一定的优势。
rhPCR引物是在高度保守的目标寡核苷酸序列区域内插入1段RNA碱基序列,形成DNA-RNA-DNA的碱基序列,并且该引物的3'-末端被化学基团封阻,该引物未切割时无法正常延伸。Rnase HII可以特异性地水解DNA-rN-DNA/DNA杂合链中的RNA,但不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键。因此只有当封闭引物与靶DNA互补时,Rnase HII才能使DNA-rN-DNA/DNA杂合链在RNA碱基的5'-侧发生裂解,留下具有3'-羟基的DNA寡核苷酸,该3'-羟基DNA寡核苷酸能够起到引物的作用,从而允许引物延伸。rhPCR利用Rnase HII的特异性作用,实现了对DNA-rN-DNA/DNA杂合链的特异水解,从而实现引物的准确延伸,提升了反应的特异性。
图2. rhPCR原理图[1]
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种简便、快速的基因扩增方法,能在等温条件下,短时间内进行核酸扩增。但由于在常温配制过程中,DNA聚合酶已经开始工作,形成非特异性的错配,容易产生少量错配和引物二聚体,这些轻微的污染都会造成假阳性。
将RNase HII应用于LAMP扩增体系后,能有效解决LAMP技术的假阳性问题,为LAMP技术更加广泛的应用于临床诊断。如图3所示,利用Rnase HII引物激活的LAMP方法(PA-LAMP),当引物与靶ssDNA配对时,Rnase HII酶特异性切割引物上的RNA,激活引物,从而允许引物延伸,实现特异性扩增,有效减少体系中的假阳性。
图3. PA-LAMP原理示意图[2]
翌圣的RNase HII(Cat#14539)来源于深渊热球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.),由翌圣镁孚泰生物ZymeEditor™重组表达而来,无核酸外切酶、切口酶、RNase残留,低宿主残留,有效减少体系假阳性。翌圣RNase HII极度耐热,95°C孵化45 min后,活性几乎不损失,可与rhPCR各反应体系兼容,也适用于LAMP等。
E. coli基因组DNA残留< 0.01copies/1 U
对不同批次的RNase H II (Cat#14539ES)进行E. coli基因组DNA残留检测,结果显示翌圣RNase H II宿主基因组DNA残留远低于0.01 copies/1 U。
对RNase H II (Cat#14539ES)进行95℃加热0~45 min后,测试RNase HII的酶活结果,结果表明翌圣RNase HII加热45 min后,酶活几乎没有损失。
图5. 95℃耐热测试
将1 U不同批次的RNase HII分别与相应的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,RNase HII无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。
图6. 核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果
产品应用
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产品名称
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产品货号
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rhPCR、LAMP
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RNase HII(2 U/μL)
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14539ES
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rhPCR
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Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL
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10726ES
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RT-LAMP
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Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)
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14402ES
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Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐热逆转录酶
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11111ES
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