涨知识 | 克隆专题六：分子克隆筛选与鉴定技术
克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。
大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。经过前几章专题的讲解分子克隆中的关键步骤，接下来讲解分子克隆流程中的最后一步——筛选与鉴定，小翌会具体解析一下筛选与鉴定阳性转化子的过程，为您的实验提供好方法。
在转化反应的菌液中，同时包含不带载体的感受态细胞菌株、不含目的片段的载体、目的片段、以及目的片段成功连接到载体的菌株。可通过抗性平板进行筛选，不含载体的菌株缺少抗生素耐受性基因，不会生长。值得注意的是，线性化载体有一定的机率自连形成环形载体，转化后有机率获得含有自连载体的菌株，其含有抗生素耐受性基因，菌株会在抗性平板上存活。为了获得片段成功插入到载体上的菌株，需进行筛选和鉴定。
筛选的定义，通过一定的条件获得含有目的片段的菌株，去除或减少不含有目的片段的菌株。具体操作为，取转化至感受态细胞中的菌液，涂布于有筛选条件的平板，放置在37℃培养箱中过夜培养，生长的菌落称为转化子。最常用的筛选技术是蓝白斑筛选法和阳性克隆筛选法。
蓝白斑筛选
蓝白斑筛选法，将外源DNA克隆到含有编码α-半乳糖苷酶功能性亚基的lacZα序列的载体中，将转化后细胞涂布到含有lacZ转录诱导子、IPTG（翌圣Cat#10902ES）、X-gal（LacZ显色底物，翌圣Cat#10901ES）的生长培养基上，lacZ转录诱导子诱导LacZ基因表达并水解X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当插入片段破坏了载体编码的lacZα基因时，无法形成功能性LacZ，经转化的菌落呈白色，白色菌落初步判定为载体、片段连接成功的转化子。蓝白斑筛选简单、快速，但是不能检测非表达型蛋白质，且线性化载体可能被转化，其末端“修复”并连接在一起，不会产生LacZα，也不会形成蓝色菌落，从而出现假阳性等现象。
图1.蓝白斑筛选原理
阳性克隆筛选
阳性克隆筛选法，即在载体的MCS（多克隆位点）中含有一个对于细菌宿主致命的基因，当插入片段成功连接到MCS内的致命基因上，可阻止其表达，从而确保只带有插入片段的转化细胞才能存活。
图2.阳性克隆筛选原理
不论是使用普通的载体连接转化后涂布于抗性平板的菌落，或是蓝白斑筛选法和阳性克隆筛选技术获得的菌落，都称其为转化子，而非阳性转化子。为了进一步验证，排除假阳性的现象，还需要进行鉴定，是指通过酶切、菌落PCR、测序等手段判定转化子中是否含有目的片段，且序列一致，即可称为阳性转化子。
酶切
对从阳性菌落或白色菌落中提取的载体进行酶切（翌圣的FuniCut™快速限制性内切酶Cat#15001ES-15051ES），凝胶电泳验证，确定其条带图谱是否与所插入目的片段的条带大小一致。其中，翌圣含有凝胶电泳验证的一整套设备，包括高质量琼脂糖（Cat#10208ES）,背景干净、带型稳定、大小精准的DNA marker（Cat#10501ES-10512ES）,安全无毒、稳定性强的核酸染料YeaRed（Cat#10202ES）、YeaGreen（Cat#10204ES）,电泳仪（Cat#80310ES）等，仪器和试剂配套齐全，满足凝胶电泳的基本需求。
酶切
还可通过菌落PCR法判断DNA片段是否插入。是指以平板上生长的细菌菌落热解后暴露的DNA为模板，直接使用PCR扩增技术扩增目的片段，以此来确定DNA插入片段的存在。该方法不需要提取基因组DNA，不需要酶切鉴定，快速、高效。
翌圣新品通用型多片段快速克隆试剂盒（Cat#10923ES），不经过酶切，利用无缝克隆技术连接的目的片段，满足6 μL小体系、25 kb以上超长片段等条件，克隆阳性率可达95%以上，转化后再搭配使用翌圣快速PCR试剂盒（Cat#10157ES），以1 sec/kb的速度扩增5 kb以内质粒等，可大幅节省PCR反应时间，快速鉴定阳性转化子。如图3、4所示。
图3.在6 μL小体系非复苏感受态下，连接10 ng低投入量单片段基因。结果显示，10923ES性能好于竞品，连接效率高，菌落数多，阳性率达100%。A-B：重组转化平板。载体（10 kb）和插入片段（1 kb）摩尔比为1:2。C：插入片段PCR鉴定电泳图，M：Yeasen 10505ES。
图4.以人源基因组为模板，分别扩增长度为1, 2, 3, 4, 8 kb的目的片段。PCR反应条件使用本公司推荐的PCR反应条件。反应结束后，取4μL进行电泳检测。Marker:15000bp DNA 。
通过分子克隆专题一到专题六，小翌详细解析了分子克隆中运用到的技术和试剂。分子克隆技术打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门，它对于工业、农牧业和医学等领域均产生深远影响，是生物研究中不可或缺的手段。关注我们，小翌会在下一期的分子克隆技术专题中给大家补充分子克隆技术的应用工具，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~
相关产品列表
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产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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蓝白斑筛选 |
X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 |
1 g/5×1 g |
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IPTG 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 |
5 g/10 g |
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通用缓冲液，5min完成精准酶切 |
FuniCut™快速限制性内切酶 |
50 T |
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快速PCR，快至1s/kb |
2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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1-7片段一步法定向连接，最快5分钟完成重组反应 |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
20 T/50 T |
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高质量琼脂糖 |
Agarose琼脂糖 |
100 g/500 g |
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核酸染料 |
YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water) YeaRed核酸染料(10,000× 水溶液) |
500 μL |
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YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water) |
500 μL |
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DNA Marker |
GoldBand DL2,000 DNA Marker |
100 T |
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GoldBand DL600 DNA Marker |
100 T |
