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精品推荐 | 合成DNA片段，何不选用快且准确的方式?

 

给各位小伙伴们推荐精品之前，小翌先给大家出一道最近小翌碰到的问题╰(*°▽°*)╯

 

问：已知Taq DNA酶的最适变性和退火时间为30秒，最适延伸速度是60秒/kb，推荐循环数为35个循环，在克隆实验中小翌合成5 kb长的DNA片段理论上需要多久呢？

 

A． 理论上大概要3个小时左右

B． 理论上大概要4个小时左右

C． 理论上大概要5个小时左右

D． 理论上3分钟，安排师弟做(￫ܫ￩)

 

答案

B：预变性5 min+(变性30s+退火30s+延伸5min)×35+终延伸10min=225min

 

实际上小翌用这类Taq DNA酶合成5 kb的片段时，都不止4个小时，PCR仪器本身还有自己的升降温时间。试想一下，合成5 kb大小的DNA片段加上电泳验证，小翌要花一个下午才能确认(。_。)。除此之外，还有个潜在的风险，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小对了，序列不对，有部分碱基突变！

 

为避免这种情况的发生，最好的办法是用一个能又快又好合成DNA片段的DNA合成酶(安排小翌的师弟做)。目前出现了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？

 

高保真DNA聚合酶相比于Taq DNA 聚合酶有所不同，两者最大的区别在于前者具有强校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。当出现错配的核苷酸时，DNA合成会因为错误的匹配而暂时停止，期间高保真DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并使用正确的核苷酸进行替换。

 

 

衡量不同高保真DNA聚合酶校正功能的指标是保真度，保真度通常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率)，指的是发生错配的核苷酸数量与合成的总核苷酸数的比值，错配率越低则表示保真度越好。

 

DNA聚合酶保真度的检测方法多种多样，例如蓝白班筛选鉴定、一代测序和二代测序等，使用不同的检测方法结果也会不一样。

 

 

 
特别推荐
 

2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix

 

 

  • 高保真好：低错配率，高GC易突变序列中碱基错配比231/300000

  • 扩增速度快：延伸速度快至5 sec/kb，省时高效

  • 适用性广：可覆盖20-80%GC含量的基因，耐受小鼠裂解物和20%的血液

  • 稳定性好：37℃下存放7天，不影响产品性能

  • 快速简便：只需加入引物和模板即可进行扩增，带有上样染料，可直接电泳

 

 
保真度高，错配率低
 
 

 

以不同物种基因组为模板，选取6段GC rich、极易发生碱基突变/丢失的片段进行扩增，将各自PCR产物克隆至载体，并对每种序列挑取100个单克隆进行测序以确认碱基序列错配/突变情况。结果显示10164ES发生碱基错配/突变的比例优于国内外品牌试剂。

 

 
10kb以内片段扩增延伸时间可达5 sec/kb
 
 

 

使用10164ES和不同产品均以5 sec/kb的延伸速度从100 ng人基因组模板扩增不同长度片段（0.4-10 kb），延伸时间均要求为5 sec/kb。结果显示，10164ES在10kb以内的片段均可以5 sec/kb的延伸速度扩增。Marker: Yeasen 10510ES。

 

 
可扩增不同GC含量的基因片段
 
 

 

使用10164ES从人gDNA模板中扩增23-76% GC含量片段，延伸时间设置5 sec/kb。结果显示，产品扩增特异性良好，能兼容不同GC含量片段扩增。Marker: Yeasen 10510ES。

 

 

可兼容不同类型的模板

 
 

 

使用10164ES从不同样本中扩增不同长度片段，延伸时间设置5-10 sec/kb。结果显示本产品扩增特异性良好，能兼容不同模板的不同片段扩增。

 

图解：1.小鼠gDNA 1 kb；2.小鼠gDNA 2 kb；3.小鼠gDNA 6 kb；4.玉米gDNA 1 kb；5.水稻gDNA 2 kb-A；6.水稻gDNA 2 kb-B；7.人293细胞cDNA 1 kb；8.人293细胞cDNA 2 kb ；9.人293细胞cDNA 3 kb；10.人293细胞cDNA 12 kb；11.大肠杆菌菌液8 kb；12.大肠杆菌菌液16 kb；13.水稻gDNA 10 kb-A；14.水稻gDNA 10 kb-B；15.水稻gDNA 10 kb-C；16.水稻gDNA 20 kb-A；17.水稻gDNA 20 kb-B；18.人血液直扩3 kb。Marker: Yeasen 10510ES。

 

 

 
用户使用反馈
 
 

动物gDNA-120bp-50%GC

 
 

 

客户评价：PCR过程速度快，条带合适，可在琼脂糖电泳中直接上样。进口N品牌的条带偏上，可能是自身的buffer影响，且未添加loading buffer，该产品可替代目前我的实验方案中的高保真酶。

 

 
植物cDNA-729bp-45.13%GC
 
 

 

客户评价：与进口T品牌相比，克隆条带更加清晰单一，整个PCR时间也更快，跑胶时不用再额外加染料，非常方便快捷。

 

 
微生物gDNA-1158、1953bp-58.8%、52.9%GC
 
 

 

客户评价：与国产V品牌相比，效果相当，个人感觉更佳。

 

 
植物cDNA-2000bp-40%GC
 
 

 

客户评价：效果很好，条带清楚。回到开头的问题，若小翌使用这款5秒/kb的快速高保真PCR Mix扩增5 kb的DNA片段用于克隆，理论上大概需要多久？

 

答案是~

 

预变性30s+(变性10s+退火5s+延伸25s)×35+终延伸2min=25min50s<<225min ᕙ(`▿´)ᕗ 省时间的同时还减少了错配情况的发生!

 

 

 
翌圣高保真PCR推荐表
 

 

 
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产品定位

产品名称

货号

规格

TA/平末端通用高效拓扑克隆

Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit

10906ES20

20 T

平末端拓扑克隆

Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit

10909ES20

20 T

平末端拓扑克隆，不含多克隆位点

Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit

10910ES20

20 T

单片段同源重组克隆

Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit

10911ES20/50

20/50 T

单多片段通用同源重组

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit

10922ES20/50

20/50 T

常规克隆感受态

TOP10 Chemically Competent Cell

11801ES80

10×100μL

常规克隆感受态

DH5α Chemically Competent Cell

11802ES80

10×100 μL

快速克隆感受态

DH5α Fast Chemically Competent Cell

11803ES80

10×100 μL

常规克隆感受态

BL21(DE3) Chemically Competent Cell

11804ES80

10×100 μL

快速PCR

2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)

10157ES03/08

1/5×1 mL

常规条带分离

Agarose琼脂糖

10208ES60

100 g

安全无毒核酸染料

YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water)

10202ES76

500 μL

 

400-6111-883