小鼠小肠类器官构建宝典
类器官（organoids）是指利用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物并具有一定的空间结构组织类似物。2021年，类器官技术被列为“十四五”国家重点研发专项，作为疾病模型，相比于传统2D疾病模型，类器官在阐明疾病的发展、稳态性和发病机理等与体内环境更加接近，在多领域将发挥重要，诸如细胞治疗、药物研发、基因工程、免疫研究、组织再生等领域。
以下内容小翌将通过讲述小鼠小肠类器官培养的全过程及相关注意事项为大家在培养过程中减少踩坑概率。
实验所需材料
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应用方向 |
材料名称 |
货号 |
规格 |
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肠组织消化 |
Cebrary®Tissue Digestion Solution 组织消化液 |
41423 |
30ml |
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70um 细胞筛网 |
542070 |
70um |
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耗材设备 |
培养皿 |
84003 |
100mm |
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离心管 |
83503/83505 |
1.5ml&15ml |
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移液管 |
84503 |
5ml |
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类器官培养支持 |
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
40191 |
5 mL |
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培养基成分及添加剂 |
DMEM/F12基础培养基 |
41420 |
500ml |
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DPBS |
41403 |
500ml |
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EDTA |
60126 |
100g |
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BSA |
36100 |
25g |
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Recombinant Human RSPO1 Protein |
92278 |
100ug |
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Recombinant Human Noggin Protein, His Tag |
92528 |
100ug |
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Recombinant Human EGF Protein |
92708 |
100ug |
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Recombinant Human Wnt -3a protein |
92276 |
100ug |
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NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸) |
50303 |
1g |
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HEPES |
60117 |
100ml |
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L-alanyl-L-glutamine solution,200mM |
60701 |
100ml |
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B-27 supplement without Vitamin A,serum free,50X |
60704 |
10ml |
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N-2 supplement,serum free,100X |
60706 |
5ml |
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类器官收集 |
Cebrary®Cell recovery solution for Organoid类器官回收液 |
41421 |
30mL |
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类器官冻存 |
Cebrary®Cell freezing medium for Organoid 类器官冻存液 |
41422 |
30mL |
小肠类器官培养步骤
样本制备：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3~15cm肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。
样本清洗：使用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现组织透明），将肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗2~3次。
样本初处理：将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽大小块状体，顺势转移至新的50ml离心管中，用DPBS轻柔清洗3-5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。
样本消化：在清洗好的小肠碎片组织加入10-15ml含有3-5mM EDTA的预冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期间每10min轻摇一次离心管。
消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。
在小肠组织碎片中加入10~15ml预冷的含0.1%BSA的DPBS，反复吹打、重悬组织碎片，使隐窝与基底层分离，然后取少许悬液镜检，当看有大量隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液使用70μm滤网过滤并收集穿过滤网的组织悬液。
重复步骤5-6两次，1500rpm、4℃离心 3min。
混合物形成：用Ceturegel®基质胶重悬隐窝组织沉淀，每10μL基质胶悬液包含200~600个隐窝，重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶形成凝胶。
注意：基质胶稀释比例≥50%以保证培养过程中Ceturegel®基质胶结构的稳定性。
将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。
将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30min左右待基质胶凝固。
待Ceturegel®基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的肠类器官培养基，每孔 800μL/孔。
将 24 孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并监测类器官生长状态，一般小鼠小肠类器官在5~7天内形成。
实验结果
图.小鼠小肠类器官体外培养结果图
小肠类器官的传代
培养5~7d或小肠类器官中央变黑时可进行传代，提前将24或12孔板放于培养箱中孵育至少30min。吸走待传代的培养液，加1mL/孔冷的DPBS，1min后挑起基质胶，用1mL枪头将基质胶轻轻吹散，用注射器一次性吸走悬液，重复操作1次，将悬液加入5mL离心管中，1200r/min，4℃、5min离心，弃上清，按每孔1∶3传代。
小肠类器官的冻存
选择生长状态旺盛的类器官(一般传代后3~4d)，进行冻存，每两孔冻存一管。吸去培养液，加入1mL细胞冻存培养液，用枪头将加入类器官回收液的基质胶吹散，后将悬液加到细胞冻存管中，放于冻存盒中，于-80℃冰箱放置1d，后转入液氮长期保存。
小肠类器官的复苏
将24孔板放于培养箱预热30min。取出液氮中的冻存管并置于37℃水浴锅中，当冻存液溶解时取出，用1mL注射器抽吸一次，然后将细胞悬液转移到15mL离心管中，1200r/min、4℃，离心5min，弃上清，加入5mL冰DPBS重悬，重复上述离心步骤，弃上清。按照类器官培养的步骤铺板和培养。
消化组织选择什么消化液，消化时长是多少？
组织的消化液可以选用EDTA或胶原酶，如果消化空腔性器官EDTA适合，如小肠和胃；胶原酶有不同类型，消化的组织类型比较广泛，可以搭配DNA酶一起。不同组织消化时间差异比较大，从十几分钟到数小时。
不同孔板培养类器官培养所需的基质胶和培养基体积?
培养类器官常用的是24孔板培养，按50μl/孔形成胶滴，再加入500μl培养基覆盖胶滴；96孔板按10μl/孔形成胶滴，再加入200μl培养基覆盖胶滴；6孔板每孔可以种植多个50μl胶滴，加入2~3ml培养基覆盖胶滴。
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类型 |
货号 |
产品名称 |
应用方向 |
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即用型 3-6 mg/ml |
40182 |
Ceturegel® Matrix Ready-to-use，LDEV-Free基质胶 |
适应于细胞培养、贴壁、侵袭和迁移实验以及细胞分化等研究 |
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基本浓度 8-12 mg/ml |
Ceturegel® Matrix LDEV-Free基质胶 |
适应于2D和3D培养、侵袭和迁移实验，也可以用于体内成瘤实验 |
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Ceturegel® Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
主要应用于需要颜色检测如荧光检测实验等 |
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高浓度 ≥18mg/ml |
Ceturegel® Matrix High Concentration，LDEV-Free 基质胶 |
主要应用于如血管生成、凝胶栓塞和体内成瘤实验（对于血管生成建议基质胶终浓度要≥10mg/ml） |
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Ceturegel® Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基质胶 |
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Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
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低生长因子 |
Ceturegel® Matrix GFR，LDEV-Free 基质胶 |
主要是排除生长因子对实验的干扰。应用于与生长因子、信号通路等相关研究。无酚红的也用来做类器官培养 |
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Ceturegel® Matrix GFR，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
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干细胞用 |
Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基质胶 |
主要用于如hESC，iPSC等干细胞培养 |
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类器官用 |
Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶 |
类器官培养专用基质胶 |
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鼠尾胶原 |
Collagen, Type I , from rat tail 鼠尾胶原蛋白I（大鼠源） |
侵袭和迁移。培养或分化研究 |
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Cebrary® Collagen, Type I , from mouse tail 鼠尾胶原蛋白I型（小鼠源） |
侵袭和迁移。培养或分化研究 |
