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miRNA的定量分析,这里有方案!

 

MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21-28个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA主要与靶基因mRNA3‘端非编码区域特异性结合,调控转录后靶基因mRNA的翻译过程,从而阻断mRNA翻译和促进mRNA降解导致蛋白质表达降低。miRNA的作用涉及个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种心血管疾病的发生发展。

 

图.miRNA体内合成示意

 

miRNA研究的关键是如何准确且特异性地检测分析miRNA。目前检测分析miRNA的方法中最为常用的是荧光定量PCR。但是miRNA本身相对较小,传统的RNA提取、反转录和定量方法难以高效的保证miRNA的检测,选对适配的方法此时则显得尤为重要。
 
传统的有机提取通常提取的是较大分子量的RNA,例如mRNA和核糖体RNA,但对于miRNA的提取效果则不太理想,可能是由于小分子量的miRNA不易被醇类沉淀。针对这个问题,翌圣匠心研发了专门针对miRNA提取的产品-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒。

 

 

 
miRNA提取产品推荐
 

19331ES-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒

 

 
产品性能
 
  • 快速,简捷,可在30分钟内完成miRNA提取

  • 不用乙醇沉淀,减少小分子RNA丢失

 

 

 
 

成熟的miRNA的长度只有20nt左右,通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分,反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。

加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾,以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物,合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链,后续扩增过程中,茎环结构在适宜的温度下会被打开,和相关扩增引物结合。

 

图. 加尾法合成miRNA

 

图.茎环法合成miRNA

 

 

 

 
反转定量产品推荐
 

翌圣miRNA加尾法反转定量组合(11148ES&11171ES)

11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

 

试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录,产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物,并经过精心优化,可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。

 

11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

 

专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂,含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶,配合特殊的Buffer体系,使反应特异性更好,灵敏度更高,并能在更广的范围内进行准确定量。

 

 
产品性能
 
  • 可兼容全平台qPCR仪器

     

 

 

以293T细胞的Total RNA为模板,用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA稀释10倍后,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6内参基因。

 

  • 检出率高,最高可达10 pg

 

 

以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T细胞Total RNA(b)为模板,分别稀释成以下梯度:60拷贝到606拷贝(6个梯度)和10 pg-100 ng(5个梯度),用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。

 

  • 高特异性,能区分同家族miRNA间单碱基差异

 

 

人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA,彼此间相差的碱基很少,甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型(hsa-miR-let-7a~Let-7i,has-miR-98)的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA,以不用的引物,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA,利用公式2-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示,可有效区分密切相关的亚型家族成员。

 

  • 扩增效率出色

 

 

以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板,扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示,与同类产品相比,Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系,具有优异的表现。

 

  • 稳定性优秀,在 37℃稳定7天或冻融50次或配置体系在25℃保留48 h,效果依旧稳定

     

 

以293T细胞Total RNA为模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 进行反转录,获得的cDNA稀释10倍,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况。△Ct<0.5。

 

  • 翌圣miRNA茎环法反转定量组合(11139ES&11170ES)

 

11139ES-Hifair®  III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

 

该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快,且热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可合成长达19.8 kb的cDNA。

 

11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

 

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液。由于miRNA序列短,且同一家族的miRNA序列往往高度相近,故在定量时对特异性要求极高。本品基于热启动的 DNA 聚合酶,配以优化的Buffer,能够极大地减少非特异性扩增;同时,特殊的ROX Reference Dye,使得预混液适应于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。

 

  • 可兼容全平台qPCR仪器

以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释40倍后,用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)分别扩增人源的mmu-miR-125a基因。

 

  • 灵敏度高,可达10 pg

 

以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA 以10倍梯度稀释(范围10pg /μL-0.1μg /μL),扩增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

 

  • 高特异性,能区分同家族miRNA间单碱基差异

 

人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA,彼此间相差的碱基很少,甚至只有单碱基的差异。以不同的引物,使用 Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)分别扩增这些miRNA,利用公式2^-△ct x 100%计算匹配率。

 

  • 重复性好

 

 

以人293T细胞的Total RNA为模板反转录,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释50倍,使用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)进行90孔平行重复实验扩增人源的hsa-let-7a基因。

 

  • 稳定性好,37℃稳定14天或冻融稳定50次或配置体系在25℃保留24h后,效果依旧稳定

     

 

以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释100倍,扩增鼠源的mmu-miR-132基因。

 

 

 
相关产品列表
 

方法类型

实验步骤

产品名称

产品货号

miRNA提取

核酸提取

MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit

19331ES

MolPure® Serum/Plasma miRNA Kit

19332ES

加尾法反转定量

反转录

Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11148ES

定量PCR

Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

11171ES

茎环法反转定量

反转录

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

11139ES

定量PCR

Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

11170ES

 

400-6111-883