MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21-28个碱基的单链小分子RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA主要与靶基因mRNA3‘端非编码区域特异性结合,调控转录后靶基因mRNA的翻译过程,从而阻断mRNA翻译和促进mRNA降解导致蛋白质表达降低。miRNA的作用涉及个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种心血管疾病的发生发展。
图.miRNA体内合成示意
19331ES-MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit 细胞/组织miRNA提取试剂盒
快速,简捷,可在30分钟内完成miRNA提取
不用乙醇沉淀,减少小分子RNA丢失
成熟的miRNA的长度只有20nt左右,通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分,反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。
加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾,以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物,合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链,后续扩增过程中,茎环结构在适宜的温度下会被打开,和相关扩增引物结合。
图. 加尾法合成miRNA
图.茎环法合成miRNA
翌圣miRNA加尾法反转定量组合(11148ES&11171ES)
11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录,产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物,并经过精心优化,可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。
11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂,含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶,配合特殊的Buffer体系,使反应特异性更好,灵敏度更高,并能在更广的范围内进行准确定量。
可兼容全平台qPCR仪器
以293T细胞的Total RNA为模板,用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA稀释10倍后,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6内参基因。
检出率高,最高可达10 pg
以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T细胞Total RNA(b)为模板,分别稀释成以下梯度:60拷贝到606拷贝(6个梯度)和10 pg-100 ng(5个梯度),用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。
高特异性,能区分同家族miRNA间单碱基差异
人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA,彼此间相差的碱基很少,甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型(hsa-miR-let-7a~Let-7i,has-miR-98)的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA,以不用的引物,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA,利用公式2-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示,可有效区分密切相关的亚型家族成员。
扩增效率出色
以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板,扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示,与同类产品相比,Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系,具有优异的表现。
稳定性优秀,在 37℃稳定7天或冻融50次或配置体系在25℃保留48 h,效果依旧稳定
以293T细胞Total RNA为模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 进行反转录,获得的cDNA稀释10倍,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况。△Ct<0.5。
翌圣miRNA茎环法反转定量组合(11139ES&11170ES)
11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快,且热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可合成长达19.8 kb的cDNA。
11170ES-Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液。由于miRNA序列短,且同一家族的miRNA序列往往高度相近,故在定量时对特异性要求极高。本品基于热启动的 DNA 聚合酶,配以优化的Buffer,能够极大地减少非特异性扩增;同时,特殊的ROX Reference Dye,使得预混液适应于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。
可兼容全平台qPCR仪器
以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释40倍后,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)分别扩增人源的mmu-miR-125a基因。
灵敏度高,可达10 pg
以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA 以10倍梯度稀释(范围10pg /μL-0.1μg /μL),扩增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。
高特异性,能区分同家族miRNA间单碱基差异
人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA,彼此间相差的碱基很少,甚至只有单碱基的差异。以不同的引物,使用 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)分别扩增这些miRNA,利用公式2^-△ct x 100%计算匹配率。
重复性好
以人293T细胞的Total RNA为模板反转录,用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释50倍,使用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix(Cat# 11170ES)进行90孔平行重复实验扩增人源的hsa-let-7a基因。
稳定性好,37℃稳定14天或冻融稳定50次或配置体系在25℃保留24h后,效果依旧稳定
以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)(Cat# 11139ES)进行反转录,获得的cDNA稀释100倍,扩增鼠源的mmu-miR-132基因。
方法类型 |
实验步骤 |
产品名称 |
产品货号 |
miRNA提取 |
核酸提取 |
MolPure® Cell/Tissue miRNA Kit |
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MolPure® Serum/Plasma miRNA Kit |
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加尾法反转定量 |
反转录 |
Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit |
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定量PCR |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |
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茎环法反转定量 |
反转录 |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) |
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定量PCR |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix |