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涨知识 | qPCR专场五：如何分析荧光定量数据？

 

荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章，走上人生巅峰呢？

 

荧光定量PCR可以通过将Ct值转化为数量用以计算每个PCR反应中初始的基因靶标数量。通常有两种方法可以将Ct值转化为数量，分别是绝对定量法和相对定量法。绝对定量主要用于检测未知样品中核酸的具体量，可通过已知浓度的标准品制作的标准曲线和未知样品的Ct值进行比较实现定量，主要应用于病原菌、病毒检测等领域。而应用最广泛的mRNA表达的研究中不需要知道具体有多少核酸量，只需要确定基因相对的表达差异，用相对定量的方法即可得到结果。相对定量是指在一定样品中目的基因相对于另一参照样品中量的变化，如比较样品处理前后或不同时期目的基因的表达变化。与绝对定量相比，相对定量更简单，应用更普遍。

 

 

 
绝对定量法
 
标准曲线模板的选择
 
 
用于制作标准曲线的模板的质量对于实验能否成功至关重要。测定初始拷贝数需要尽可能均匀的纯模板，常见的有DNA标准品和RNA标准品，不同的标准品有着各自的优缺点。

 

 
标准曲线的制作
 
 
在制作曲线之前，需对模板准确量化。确定模板中核酸的拷贝数，将模板按照梯度稀释10倍，稀释成8-10种包含不同核酸拷贝数的模板。对不同稀释程度的模板进行荧光定量PCR，每种模板进行至少三次重复。由此得到的标准曲线将具体拷贝数和特定的Ct值相关联。将未知拷贝数模板荧光定量PCR后获取的Ct值与该标准曲线进行比较，即可得到具体的拷贝数值。定量的准确性和标准曲线的质量直接相关。

 

 

 
标准曲线的验证
 
 
制作完标准曲线后，需进行多项验证，用以确保标准曲线是有效且准确的。
主要验证的方面如下：

  • 线性范围和灵敏度验证：检测线性范围中的最高点和最低点浓度；

  • 模板质量验证：分光光度计分析260/280、260/230比值；

  • 数据精度验证：重复组内的Ct值差距应≤0.5；

  • 扩增效率验证：斜率尽可能接近-3.3，相当于扩增效率尽可能接近100%，测试前后斜率尽可能一致。

 

 

 
相对定量法
相对定量法中常见的是比较Ct法，其中主要包括2-ΔΔCt法，Pfaffl法和ΔCT法，目前诸多科研人员采用最多的是2-ΔΔCt法。虽然该方法应用广泛，但是很多人却不了解其中的原理，例如为什么要用内参基因的Ct值？为什么是ΔΔCt而不是ΔCt？为什么是负的ΔΔCt？接下来，小翌就为大家讲解清楚。

 

 
2-ΔΔCt法讲解
 
 

 

内参基因通常是一种始终保持着低水平甲基化且一致处于活性转录状态的基因，高度保守且在大多数情况下持续表达，其表达水平受环境因素影响较小。通常在检测基因的表达水平时用作参照物，校正操作、上样量差异等带来的实验误差，从而保证结果的准确性。

理论状态下，PCR扩增呈现指数增长，每次循环增加一倍的量，用数学表示，则为2的Ct次方。当产物量到达同一水平，但对应的Ct值不同，其原因在于初始的模板量差异。将其做比，可了解他们的模板量的差异，如下：

 

 

仅了解目的基因和内参基因之间的初始模板量比值是难以判断基因变化的情况(表达量变化的差异)，通常我们会选用正常组(野生型)和实验组来比对分析，经过一系列处理后，研究对象对应的目的基因表达是否受到影响。例如下方例举的药物测试实验：
 
测试一款减少黑色素表达的药物，该药物以灌胃的形式给药至实验组小鼠，对照组小鼠仅以正常饮用水进行灌胃，以往大量研究已表明该药物对于黑色素表达有明显的抑制作用。

 

 

如果研究目的基因，简单仅以两组的目的基因表达量相比，可以发现，实验组生成黑色素的基因表达量相比于对照组要多四倍。

 

 

然而已有大量研究证明该药物抑制黑色素表达，与已有理论存在相悖的情况。存在该情况的原因可能主要是两组小鼠RNA提取的时候处于不同的时间、提取样本量不一样、cDNA上样量不一样、cDNA浓度不一样等等。
 
为避免各类潜在差异带来的影响，需引入内参基因，可见上图右半部分。同样样本，在原测试目的基因的基础上，加测内参基因。对照组得到的目的基因与内参基因之间的模板比值为正常老鼠目的基因的比例关系，理论状态下，以该比例×实验组老鼠恒定表达的内参基因表达量即可获得实验组老鼠在正常状态下目的基因的理论表达量，实际实验组老鼠目的基因表达量除以理论表达值，即可计算出老鼠在药物处理下，目的基因的表达量变化情况，具体如下：

 

 

以上结果可以得出，实验组目的基因表达量仅为对照组的1/2，也符合以往研究报道。
 
以上是对荧光定量数据分析得介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，对如何分析数据已经有一定的了解啦。关于如何做好qPCR实验，小翌会陆续在公众号里传授秘籍哒，敬请期待哦。

 

 

 
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