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干货│从原理到应用，带你全方面了解T4 gene 32 protein

T4噬菌体基因32编码蛋白(T4 gene 32 protein，gp32)是一种单链DNA（ssDNA）结合蛋白，为T4噬菌体DNA复制和修复所必需。它被广泛地用于稳定和标记ssDNA区域，以便用电子显微镜观察细胞内DNA的结构、促进限制性内切酶的消化反应、提高RT-PCR中反转录的效率、增强T4 DNA聚合酶的活性和提高PCR的产量等。

 

 

 
T4 gene 32 protein的结构
T4 gene 32 protein由301个氨基酸组成，大小为34 kDa，包含三个不同的结构域：核心结构域、N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）。
 

  • 核心结构域：包含ssDNA的结合位点，并具区分单链、双链DNA的能力；

  • C端结构域（CTD）：涉及异型蛋白相互作用，带负电荷，调节gp32与复制、修复和重组机制中其他成分的相互作用；

  • N端结构域（NTD）：负责同型蛋白相互作用，带正电荷，与邻近的gp32单体的核心结构域之间通过蛋白-蛋白接触，使gp32蛋白以头-尾方向结合ssDNA。

 

图1. gp32结构域[1]

 

 

 
T4 gene 32 protein介导的DNA重组修复
A.
DNA损伤时，后随链合成冈崎片段，gp32与前导链结合

当前导链聚合酶(红色)在DNA损伤处（X）停滞时，前导链和后随链的合成会解耦联，后随链的合成机制可以合成与受损部位重叠的冈崎片段(绿线)，同时会在停滞的前导链聚合酶前面打开一个ssDNA缺口，该缺口被gp32覆盖(橙色)；

B.

模板子链3 '端解旋

gp32单体簇通过阻止Dda解旋酶加载到后随链上来阻止其对复制叉移动的刺激，并促进模板子链3 '端的解旋；

C.

模板转换恢复复制叉移动

UvsX重组酶和Dda解旋酶催化模板转换来恢复停滞的复制叉；

D.

跨损伤DNA合成

进行后续无错误的跨损伤DNA合成。

 

图2. gp32介导的重组修复过程[2]

 

 

 
T4 gene 32 protein应用
01
重组酶聚合酶扩增
 
 
（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）
该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测，具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

 

图3. 重组酶聚合酶扩增RPA技术扩增原理图[3]

 

RPA具体流程如下：

 
01
 
重组酶引物复合体的形成

重组酶T4 UvsX在ATP的参与和定位因子（T4 UvsY）的帮助下与扩增引物结合形成重组酶引物复合体，并在双链DNA中寻找同源序列；

02
 
重组酶引物复合体定位至同源序列

重组酶引物复合体一旦定位到同源序列，则会插入双链DNA形成D-环结构，启动链置换反应，单链结合蛋白gp32会与解开的DNA链结合防止进一步被置换；

03
 
链置换扩增启动

重组酶T4 UvsX从重组酶引物复合体中被水解，3'端引物暴露并与Bsu DNA聚合酶结合，DNA开始复制延伸，最终两条母链分离，形成两条新的互补双链DNA。该反应在37-42℃下进行，可在30 min内实现目标序列1012倍的扩增。

 

02
核酸依赖性扩增检测技术
 
 
（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）
该技术由一对引物介导，反应在42℃进行，可在2 h左右将模板RNA扩增约109～1012倍，不需特殊的仪器，具有较高的特异性和灵敏度。广泛应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测，特别是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA病毒的检测当中。在动物疫病预防控制方面，NASBA方法已成为诊断禽流感病毒的国家诊断标准方法之一（GB/T19440-2004 禽流感病毒NASBA 检测方法）。

 

图4. NASBA工作流程图[4]

 

在NASBA中加入gp32，可以稳定逆转录形成的单链cDNA，减少NASBA中对热退火步骤的依赖，提高NASBA程序的简单性。

 

03
其他应用
 
 
1）PCR扩增中，使用gp32可以显著地提高片段的扩增长度及产量[5]，并减轻血红素、腐殖酸等抑制物的对PCR扩增的抑制作用[6]。如图5所示，将指定浓度的抑制剂加入含有5 pg模板DNA的反应混合物中，另外在不添加抑制剂的情况下，检测0.05、0.5和5 pg模板DNA的扩增情况。结果显示在PCR体系种添加gp32可显著减轻抑制剂对PCR扩增的抑制。

 

图5. T4 gene 32 protein解除抑制剂对PCR的干扰[6]。A：不含gp32的标准PCR条件；B：含有150 ng/mL gp32的PCR条件

 

2）Gp32通过阻止模板ssDNA和RNA二级结构的形成，分别增强T7 RNA聚合酶和逆转录酶的活性，从而增加体外转录和逆转录的产量[7]。

 

 

 
翌圣T4 gene 32 protein
翌圣的T4 gene 32 protein由ZymeEditor酶改造平台重组表达而来，蛋白纯度高，核酸酶残留水平低，批次间稳定性优异，宿主DNA残留水平极低，适用于RPA、NASBA技术、PCR、NGS文库构建等应用。

 

 

 
客户测试案例展示

图5.客户测试翌圣重组酶聚合酶核心酶原料扩增结果图
注：2、4为阳性实验组；1、3为阴性对照组

 

客户采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 进行RPA扩增反应，得到正确的目的条带，且条带清晰、明亮，结果表明，翌圣重组酶聚合酶扩增核心酶原料可实现高效RPA等温扩增。

 

 

 
RPA产品推荐

产品名称

产品货号

产品作用

Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)

11078ES

结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的DNA模板

T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)

11079ES

具有配对和链转移活性的重组酶

T4 UvsY protein (2 μg/μL)

11080ES

重组酶辅助因子，刺激T4 UvsX的单链DNA依赖性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX临界浓度

T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌体基因32编码蛋白

11081ES

参与DNA复制、修复、重组与解链后的单链DNA结合，防止自杂交

Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶

14502ES

刺激ATP和肌酸分解为磷酸肌酸和ADP，释放能量

Exonuclease III (100 U/μL)

14525ES

具有3’→5’外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光
参考文献
[1] Cashen BA, Morse M, Rouzina I, Karpel RL, Williams MC. Dynamic structure of T4 gene 32 protein filaments facilitates rapid noncooperative protein dissociation [published online ahead of print, 2023 Jul 14]. Nucleic Acids Res. 2023;gkad595.
[2] Jordan CS, Morrical SW. Regulation of the bacteriophage T4 Dda helicase by Gp32 single-stranded DNA-binding protein. DNA Repair (Amst). 2015;25:41-53.
[3] 王亚楠, 陈昌国. 重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J]. 解放军医学杂志, 2021, 46(5):8.
[4] Nai YH, Doeven EH, Guijt RM. An improved nucleic acid sequence-based amplification method mediated by T4 gene 32 protein. PLoS One. 2022;17(3):e0265391. Published 2022 Mar 24.
[5] Schwarz K, Hansen-Hagge T, Bartram C. Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res. 1990;18(4):1079.
[6] Kreader CA. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl Environ Microbiol. 1996;62(3):1102-1106.
[7] Piché C, Schernthaner JP. Optimization of in vitro transcription and full-length cDNA synthesis using the T4 bacteriophage gene 32 protein. J Biomol Tech. 2005;16(3):239-247.

 

 

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