荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章？

在进行荧光定量实验时，我们通常会接触并使用三种图表，分别是扩增曲线、标准曲线还有熔解曲线。曲线中出现的图形分别代表着什么？对我们的实验结果有什么帮助？类似于荧光阈值、扩增效率、Tm值定义是什么？发挥着什么样的作用等等？了解这些元素背后的意义，将有助于我们设计实验方案、后续系统分析实验结果~

在荧光定量PCR实验进程中，荧光定量PCR仪会对整个PCR反应扩增过程进行实时的检测并记录荧光信号，随着反应循环数的增加，记录的荧光信号也不断的累积。荧光定量PCR扩增曲线便是一条以循环数为横坐标和荧光强度变化为纵坐标的荧光曲线。通常见到的荧光定量PCR扩增曲线会有两种展现形式，分别是对数图谱和线性图谱，其中会包括基线、荧光阈值、CT值、指数增长期等。

基线是指初始PCR的最初几个循环中(通常为第3 至15个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的信号相当于PCR反应的背景或“噪声”。该背景信号通常主要来自于反应管中的反应体系，随着反应的不断进行，累积的荧光信号会超过背景信号，从而进入下一时期。基线期通常情况下由仪器自动划定。

随着PCR“一生二，二生四，四生八”的指数型扩增，荧光信号也呈现相应的指数型的荧光信号积累。该时期所有反应试剂均有盈余，DNA聚合酶仍保持着高水平的活力，扩增产物也相对较少，不会竞争引物的结合作用。该时期的PCR反应具有高度特异性和精确性，只有在这个时期Ct值和初始模板量之间存在线性关系，故该时期也最适用于定量分析。

理想的PCR反应方程：X_n = X₀*2ⁿ

现实的PCR反应方程：X_n = X₀* (1+E_n)ⁿ

（备注：n表示扩增反应的循环数，X₀表示初始模板量，X_n表示第n次循环后的产物量，E_n表示扩增效率）

在指数增长期时，E_n是一个固定值(理想状态下100%)，其中的变量只有初始模板量X₀和循环数，方便计算。

随着原料的消耗、产物的积累、酶活的损耗等，DNA的扩增不再呈指数扩增，荧光信号的增长也逐渐放缓。

由于底物耗尽，酶活性降低等因素，荧光信号不再呈指数型增加，趋于平稳。在实际操作过程中，由于每个反应孔中的每个样品可能具有不同的反应动力学，每个反应孔进入平台期的时间点会有所不同，最终的产物含量也各不相同。

荧光定量PCR仪通常将荧光阈值自动设置为基线期荧光值标准差的10倍。其存在的目的主要是将相关扩增信号从背景中区分出来，从而用于定量计算。荧光阈值遇到特殊情况可以手动调整，但务必保证阈值线与扩增曲线的交点位于指数增长期。

CT值表示每个反应管内荧光信号到达设定的荧光阈值时所经历的循环数。在扩增曲线图上显示为扩增曲线与荧光阈值线交叉点所对应的横坐标。CT值可用于计算起始DNA拷贝数，研究显示，CT值与靶标的起始量成反比，起始量约多，CT值约小，反之亦然。靶标起始量之间的差别通常可以通过CT值粗略估算出来。靶标起始量差了2倍的情况下，CT值的差异通常为1左右(2¹=2)；靶标起始量差了10倍的情况下，CT值的差异通常为3.33左右(2^3.33=10)。

通常情况下将已知浓度的样品(市面上购买的标准品或自己构建的质粒)经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到一系列的CT值，以已知的稀释梯度的浓度的对数作为横坐标，浓度所对应的CT值为纵坐标绘制曲线，即可得到一个标准曲线。通过标准曲线中的一些参数，可用于判断相关实验样本同样靶标的起始量或者评估反应效率。

R²值又称为拟合优度，通常用来描述数据对模型拟合程度的好坏，表示横坐标自变量对纵坐标因变量的解释程度。理论上，R²要等于1，荧光定量实验中越接近1表示回归拟合效果越好，一般荧光定量PCR标准曲线至少要求0.98以上。

标准曲线的斜率可用于检测扩增效率。通常情况下，为了获得准确且可重现的结果，反应的效率需尽可能接近100%，相当于-3.32的斜率。当反应的效率在90%-110%时，相当于-3.58至-3.10的斜率。

正如上方斜率所提到的，扩增效率可用斜率来进行计算。计算方程为：

效率 = 10^{（–1/斜率）} – 1

理论上，在指数扩增循环中，PCR产物是2倍增加，反应效率为100%，由100%=10（–1/斜率） – 1可推算标准曲线斜率为-3.32，良好的扩增效率需在90%至110%之间，其对应的斜率在-3.58至-3.10之间。实际操作时，若扩增效率低于90%，则表明扩增效率偏低，偏低原因可能来自于引物设计不当，或者反应条件未优化；若扩增效率高于100%，可能是梯度稀释样品加样错误，或者出现类似引物二聚体的的非特异产物扩增。当扩增效率不在90%至110%之间时，建议重新设计引物或探针。

上图显示了不同扩增效率的荧光定量PCR反应，该反应初始模板量均为1拷贝。数据显示扩增效率差异在PCR反应早期不会造成太大的影响。但随着反应的进行，在30个循环后，100%扩增效率所得到的产物和扩增效率为70%所得到的产物之间存在131倍的数量差异。因此，在循环次数相对较多且需要精确测试的实验中，保证好的扩增效率尤为重要。

熔解曲线通常出现在染料法荧光定量PCR中，在扩增阶段，染料分子会结合于DNA双螺旋的小沟区域，发出较强的荧光信号。而在熔解曲线阶段，随着反应温度的不断升高，结合染料分子的双链DNA会解离成单链DNA，染料分子脱离DNA，荧光信号减弱。当到达双链DNA解链温度Tm时(即DNA双链解链一半时)，荧光信号急剧下降。以荧光强度和温度或荧光变化和温度变化作图，即可清晰显示熔解曲线的动态变化。左图为荧光和温度作图得到的原始熔解曲线，右图为将温度与荧光信号的变化求导作图(-dI/dT)，得到的熔解曲线。通常使用右图的熔解曲线进行分析更加简便直接。

熔解曲线分析是一种简单、直接的分析方法，可用于分析荧光定量PCR反应中的引物二聚体、其他非特异性扩增等等，以确保反应的特异性。DNA的解链温度Tm受DNA长度、GC含量以及是否存在错配碱基等因素的影响，因此还可以通过熔解曲线区分不同的PCR产物，不用再花时间和精力进行凝胶电泳分析。

以上是对荧光定量PCR相关图表的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，今后在实验图表上分析具体实验情况更有把握啦。关于如何做好qPCR实验，小翌会陆续在公众号里传授秘籍哒，敬请期待哦。