涨知识 | qPCR专场一：如何做好扩增片段和引物设计？
荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。
*1 OLIGO Primer Analysis Software
*2 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
非特异性产物本身会和SYBR 染料结合导致荧光产生，从而人为地改变反应的Ct值。非特异性扩增可以通过竞争反应组分来影响反应效率，从而导致数据准确性降低。引物二聚体是一类常见的非特异性扩增产物。引物二聚体通常是由正向和反向引物之间的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的结果，或者单个引物自行折叠的结果。如果二聚化以交错的方式发生作用，则可能发生一些片段延伸，导致产物接近预期靶标片段的大小，产生假阳性结果。
对于同一个基因名来说，可能会有不同的isoform。isoform指的是，对于同一个基因，它的mRNA有多种不同剪接方式，这个时候表达出来的的蛋白可能会有不同，所以小伙伴们在设计实验的时候，一定要想清楚自己要做的是哪一个isoform。
举个“栗子”：比如说一个基因有四种不同的isoform，如果大家想要检测的是四种不同剪接方式转录本之和，那么设计引物时就要针对这四个isoform的共有序列设计。如果只想检测其中一种isoform，那就要在这个isoform与其他三个isoform的不同序列位置设计引物。
跨越内含子设计引物可以区分并且规避基因组DNA (gDNA)污染。gDNA可能与目的转录本共扩增，产生无效的数据。在荧光定量PCR实验中避免gDNA干扰的最佳方式是严谨的引物设计。
引物设计的序列最好选择相邻的外显子或一端或两端引物跨越内含子设计。当上游和下游引物在同一外显子内发生退火时，其可扩增DNA和RNA上对应的序列。当引物在相邻外显子中退火时，只有cDNA会被扩增，因为此时源自gDNA的扩增片段会包括内含子序列，导致扩增子太长，无法在荧光定量PCR的反应条件下有效扩增。
以人基因组来说，平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子，80%的外显子长度小于200bp，少于10%的内含子长度在1100bp以上，不到0.01%的内含子长度小于20bp。例如外显子长度200bp，为了兼顾扩增子长度，我们可以把上游引物设置在外显子1和外显子2的中间，下游引物设置在外显子2的位置。
以上是引物设计需要注意的问题，在初步设计好引物之后，我们需要在NCBI上进行BLAST检验，来确保产物的特异性。
打开NCBI，选择“Gene”，输入想要检测的基因名称，我们以人基因“ALAD”为例。
会出现很多搜索结果，我们选择需要的种属来源，即“human”，如果你知道Gene ID（每个基因有且只有一个特定的ID，类似于人的身份证），也可以根据Gene ID来选择。这里我们选择搜索结果中的第一个。
确定NM号点击后，可以看到这个isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因长度3129bp，CDS代表编码蛋白区域149-1141bp
以及此基因的序列，如下图所示。此序列就是设计引物时对应的模板。
引物设计软件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在线网站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi） 、NCBI 的Primer BLAST等。在手头没有安装合适的软件的时候，我们可以选择在线网站设计引物。
这里以延续第一步使用NCBI确定靶基因的步骤为例。了解完我们所需的isoform后，我们可以点击右侧的“Pick Primers”，就能直接进入Primer-BLAST的页面进行引物设计了。
在弹出来的界面里粘贴模板序列或者输入基因序列号。另外需要设置“上下游引物位置”和“扩增子长度”。最主要的设置就是这两点了，另外还有“物种名称”、“数据库”等其他选项可以设置。
设置好之后，点击页面左下角的“Get Primers”。
弹出如下界面，点击“Check”
以第二步中使用的Primer-BLAST为例，输入设计好的上下游引物，其他参数不做调整改动，提交后即可看到输入的引物是否在其他基因上也存在，若全部显示在目标扩增的基因中，说明引物的特异性达标。
以上是对qPCR扩增片段和引物设计的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，对如何设计扩增片段和引物已经有一定的了解啦。关于如何做好qPCR实验，小翌会陆续在公众号里传授秘籍哒，敬请期待哦。
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方法 |
分类 |
产品名称 |
货号 |
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RNA提取 |
同Trizol提取 |
TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent |
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动物组织/细胞总RNA提取，避开有毒试剂，最快15 min完成 |
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit细胞/组织总RNA提取试剂盒 |
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简单植物总RNA提取，避开有毒试剂，最快40min完成 |
MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取试剂盒 |
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多糖多酚植物总RNA提取，最快30min完成 |
MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取试剂盒 |
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细胞总RNA提取，避开有毒试剂，最快8 min完成 |
MolPure® Cell RNA Kit 培养细胞RNA提取试剂盒 |
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qPCR染料法 |
高灵敏通用型定量预混液(染料法) |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix |
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超高性价比定量预混液 (染料法)，已发文章累计IF达到5000+ |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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高灵敏型qPCR预混液（染料法） |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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miRNA加A法高特异性定量预混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） |
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miRNA茎环法高特异性定量预混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（茎环法） |
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高灵敏一步法反转定量试剂盒(染料法) |
Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit |
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细胞直扩RT-qPCR，1.5 h从细胞到基因表达分析(染料法) |
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit |
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反转录试剂 |
5 min快速反转，最长可满足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR)-示踪版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit |
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5 min快速反转，最长可满足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR)-常规版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） |
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15 min一步完成gDNA去除与反转录(下游应用qPCR) |
Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR |
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高质量第一链cDNA合成预混液，含gDNA去除(下游应用qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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最长可满足19.8 kb cDNA合成试剂盒，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) |
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常规30 min反转预混液,含gDNA去除（下游应用qPCR） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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miRNA反转录试剂盒（加A法） |
Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） |
